“康脉Ⅱ号胶囊”对迁延期下肢深静脉血栓形成大鼠血管内皮细胞凋亡的影响

“康脉Ⅱ号胶囊”对迁延期下肢深静脉血栓形成大鼠血管内皮细胞凋亡的影响

李令根1王艳明2黄艳洪3

（1黑龙江中医药大学附属第一医院；2黑龙江中医药大学2006级博士研究生)

(3黑龙江中医药大学2006级硕士研究生黑龙江哈尔滨150040）

【中图分类号】R944.5【文献标识码】B【文章编号】1672-5085(2009)13-0216-03

【摘要】目的观察康脉Ⅱ号胶囊对迁延期下肢深静脉血栓形成大鼠血管内皮细胞凋亡的影响。方法40只大白鼠随机取10只作为空白组，造模后随机分为3组，迁延期模型组、迁延期康脉Ⅱ号胶囊组、迁延期通塞脉片组，于造模后第3周开始灌胃给药，迁延期康脉Ⅱ号胶囊组给予康脉Ⅱ号胶囊、迁延期通塞脉片组给予通塞脉片，空白组与模型组给予生理盐水。结果模型组血管内皮细胞大量凋亡，通塞脉片组凋亡细胞数量减少，而康脉胶囊组凋亡细胞数量减少较通塞脉片组更为明显。结论康脉Ⅱ号胶囊能明显减少迁延期下肢深静脉血栓形成大鼠血管内皮细胞的凋亡。

【关键词】迁延期下肢深静脉血栓形成康脉Ⅱ号胶囊细胞凋亡

下肢深静脉血栓形成（LDVT）是常见的周围血管疾病，因其日益增长的发病率及严重的并发症已经引起了世界的关注。1996年，FIinn报告，美国每年发现LDVT患者高达26万人。尽管国内尚无流行病学调查，但临床报道也在逐年增加，呈上升趋势。

目前国内外对本病的治疗尚无理想方案。临床一般把LDVT分为急性深静脉血栓形成和深静脉血栓形成后遗症期两个阶段，然而在这两个阶段之间还存在一段很难界定的病理过程，这就是我们一般认为的急性期的3周之后到后遗症期的半年或数年之间。这一阶段是目前深静脉血栓形成治疗中的消极阶段，同时也是我们病历统计中就诊和住院病人最多的时段，我们把这一阶段称为下肢深静脉血栓形成的迁延期[1],因此确定这一阶段的存在从而寻找有效的治疗方法是当前最重要的。

1实验材料

1.1实验动物

纯系Wistar健康大白鼠，雄性，40只，8周龄，体重250±20g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，合格证编号：SCSK黑2008004

1.2实验药物及试剂

康脉Ⅱ号胶囊”为黑龙江中医药大学附属第一医院全国周围血管疾病治疗中心常规用药（主要成分蓬子菜、茯苓、三棱、莪术、水蛭、甘草）；通塞脉片：由南京金陵制药厂生产；血管内皮细胞凋亡检测试剂盒:由北京中山提供的TUNEL试剂盒,采用TUNEL方法。

2实验方法

2.1动物分组

40只大白鼠随机取10只作为空白组，造模后随机分为3组，迁延期模型组、迁延期康脉Ⅱ号胶囊组、迁延期通塞脉片组每组各10只。

2.2造模方法

采用改良结扎法［2.3］制作激素致血瘀大鼠股静脉肽夹结扎造栓的动物模型

大鼠40只,适应性饲养一周后称重，造模前一天禁食水。第二天行股静脉造栓，用戊巴比妥钠(50mg/kg体重)腹腔注射麻醉，麻醉后开腹，分离其下腔静脉，游离左髂静脉，在近、远心端用两枚肽夹阻断此静脉，两枚肽夹间距1cm，缝合腹壁。大鼠苏醒后自由饮水，进食，普通饲料喂养。24小时后，按原有放肽夹步骤取出肽夹

2.3给药方法

于造模后第三周开始给药，康脉Ⅱ号胶囊组：康脉Ⅱ号胶囊0.56粒/Kg(按60kg体重人每日用量15粒换算),用生理盐水稀释成10ml/Kg,灌胃，每日一次；通塞脉片组：通塞脉片0.75粒/Kg(按60kg体重成人，每日用量20粒换算)，用生理盐水稀释成10ml/Kg，灌胃，每日一次，治疗4周后取材。

2.4标本的采取

取标本前1天大鼠禁食，次日采用戊巴比妥钠麻醉，开腹，剪取左髂静脉（连同血栓一同剪下），立即投入投入4%多聚甲醛溶液中固定12h后，梯度酒精（Ａ）脱水(80%A→95%Ａ×2→100%Ａ×3)，二甲苯透明，石蜡包埋。切片厚度5μm和15-20μm，裱贴于载玻片上60℃恒温烤箱中烤片12小时后备用。

2.5原位末端标记检测细胞凋亡按试剂盒说明进行操作

3结果

3.1镜下改变凋亡细胞体积缩小，核固缩，致密浓染，细胞核呈棕黄色，正常细胞呈绿色。空白对照组中未见凋亡细胞，模型组见大量细胞凋亡，通塞脉片组凋亡细胞数量减少，而康脉胶囊组凋亡细胞数量减少较通塞脉片组更为明显。

3.2统计学分析

用Ridit检验,空白对照组、迁延期模型组、康脉Ⅱ号胶囊组、通塞脉片组的组间比较P<0.01,说明组间差异显著。再用Ridit检验分析康脉Ⅱ号胶囊组与通塞脉片组，P<0.05,说明治疗组疗效优于对照组。

4讨论

内皮细胞（EC）是位于循环系统血管壁内皮下组织之间的一层单层细胞，目前已发现它具有多种复杂的生理功能，能够主动分泌许多生物活性物质，调节多种组织器官的新陈代谢与功能，直至参与调控其生长发育和病理变化。生理情况下血管内皮主要有抗血栓形成作用，与血管内皮细胞的诸多功能活动有关。

细胞凋亡是机体生长发育、细胞分化和病理状态中细胞自主性死亡的过程。调节控制细胞凋亡的基因有存活基因和致死基因两大类。存活基因的过量表达可阻止细胞的凋亡；致死基因包括Bcl-2家族的另一些成员的基因、ICE家族基因以及p53基因等。细胞因子、激素和细胞间质等细胞外部因素可能通过信号传递途径影响基因表达而间接地调节细胞凋亡。

虽然凋亡是细胞本身基因控制的自主过程，许多细胞外的基因也可对细胞凋亡施加影响。这些影响往往是关键性的。在机体的生长发育以及病理过程中，细胞外种种因素可以通过形形式式的信息传递来影响细胞内调节细胞存亡的基因，从而决定某个细胞的存亡。

近年来对细胞凋亡在血管疾病发病中作用的研究已更新了人们对许多血管疾病的认识，人类组织器官通常由不同种类的细胞构成，例如心脏的主要细胞是心肌细胞和心肌间质细胞，血管则以内皮细胞和平滑肌细胞为主。由于细胞类型的差异，在致病因素的作用下，有些细胞可以表现为凋亡不足，而另一些细胞则可表现为凋亡过度，因此在同一疾病或病理过程中两种情况也可同时并存。大多数血管性疾病即属于这种情况，对血管内皮细胞而言是凋亡过度，对平滑肌细胞来说则是凋亡不足。血管内皮细胞在血管发育中起重要作用。大量实验结果表明，血管内皮细胞凋亡导致的血管功能异常，将引起多种疾病的产生，如血栓性疾病，调控血管内皮细胞凋亡是治疗血管类疾病的有效手段。血管内皮细胞的过度凋亡会使血管内皮抗血栓的作用减弱。因此要防止血栓形成，就要保护血管内皮细胞，阻止其功能异常，从而防止其过度凋亡是最有效的措施。

本研究中，光镜下观察迁延期模型组大鼠血管内皮细胞大量凋亡（+++），正常对照组只有极少量表达（±），通塞脉片组中量表达（++），康脉Ⅱ号胶囊组少量表达（+）。说明康脉Ⅱ号胶囊能抑制迁延期下肢深静脉血栓形成大鼠血管内皮细胞的过度凋亡，其机制可能是通过保护血管内皮细胞，减低血管内皮功能的破坏。

参考文献

[1]李令根，赵刚，杨博华等.下肢深静脉血栓形成临床分型讨论[J]中华医学研究杂志，2001，1（1）：47.

[2]ReyerL.Failureofasprinatdifferentdosestomodifyexperimentalthrombosisinrat.ThrombRes,1980,18:669.

[3]陈奇.中药药理研究方法学.北京:人民卫生出版社,1993.511.