多种抗原对树突状细胞促成熟作用的研究

多种抗原对树突状细胞促成熟作用的研究

田发青1季德兰2李举亨1唐玫琴1李惠卿3

田发青1季德兰2李举亨1唐玫琴1李惠卿3黄映彩3成小慧1

（1深圳市龙岗区人民医院血液内科广东深圳518172）

（2深圳市龙岗区人民医院中央悦城社康广东深圳518172）

（3深圳市龙岗区人民医院血细胞实验室广东深圳518172）

【摘要】目的:研究多种抗原促进树突状细胞（dendriticcells，DCs）成熟作用。方法：外周血单核细胞培养为DC，分别负载卡介苗、肺炎球菌疫苗、麻疹疫苗、K562及RPMI8266冻溶抗原后与T淋巴细胞共培养，以单独加入TNF-a为对照组，再加入相同体积培养基作为空白对照，观察DC形态，流式细胞仪分析DC表型，CCK8法测定混合淋巴细胞反应（MLR）。结果：各组均培养出具有典型形态的DC，其中疫苗各组细胞CD83表达较肿瘤细胞各组明显升高，MLR作用强，而肿瘤组抗原又较对照组和空白对照组为高，同时各实验组CD1a表达较对照组和空白对照组明显降低，P<0.05，但各实验组CD1a表达未见明显差异，P>0.05。结论：卡介苗、肺炎球菌疫苗及麻疹疫苗等微生物抗原促进DC成熟能力较K562及RPMI8266等肿瘤抗原能力强。

【关键词】抗原；树突状细胞；CD83；混合淋巴细胞反应

【中图分类号】R331.1+44【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2016）08-0385-02

Multiplekindsofantigeninducedendriticcellstomaturation1TianFaqing,2JiDelan1LIJuheng,1TangMeiqin,3LIHuiqing,3HuangYingcai,1ChengXiaohui1DepartmentofHematology,LonggangDistrictPeople’sHospitalofShenzhen;2BloodCellLaboratory,LonggangDistrictPeople’sHospitalofShenzhen,Guangdong,518172,China

【Abstract】ObjectiveToinvestigatethecapabilityofmultiplekindsofantigens(Ags)topromotedendriticcells(DCs)mature.MethodsDCswereinducedfromperipheralbloodmononuclearcellsloadeddifferentAgssuchasBCG,pneumococcalvaccine,measlesvaccine,K562andRPMI8266-freeze-thawAgs,thentobeco-culturedwithTlymphocytes.TNF-aonlywasaddedascontrolgroup,andTNF-aandthesamevolumeofmediumasAgwereaddedasablankcontrol.DCmorphologywasobservedbyinvertedmicroscope,DCphenotypewasanalyzedbyflowcytometry,andmixedlymphocytereaction(MLR)wasdeterminedbyCCK8kits.ResultsCellsineachgroupwereinducedtohavethetypicalmorphologyofDC,whichCD83expressionwassignificantlyhigherinvaccinegroupsthanintumorcellgroups,andwashigherintumorcellgroupsthanincontrolgroupandblankcontrolgroup,whileCD1aexpressionwassignificantlylowerineachexperimentalgroupthanincontrolgroupandblankcontrolgroup,P<0.05,butCD1aexpressionineachexperimentalgrouphadstillnosignificantdifference,P>0.05.ConclusionMicrobialAgssuchasBCG,pneumococcalvaccineandmeaslesmaybetterpromoteDCmaturationthantumorcellantigenssuchasK562andRPMI8266.

【Keywords】Antigen;Dendriticcell;CD83;Mixedlymphocytereaction

树突状细胞（dendriticcells，DCs）是目前已知的功能最强大的抗原递呈细胞[1]，DC在人体内所占数量极微，约为外周血单个核细胞总数的0.5～1.0%。目前以GM-CSF、IL-4处理末梢血中的单核细胞或CD34细胞,可诱导培养出大量DC。本课题观察各种不同抗原刺激对DC功能的影响。

1.材料和方法

1.1主要试剂

卡介苗（BCGV）、肺炎球菌疫苗、麻疹疫苗为友情惠赠，rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-α，抗人CD1a-PE、CD4-FITC、CD11c-PE、CD80-FITC、CD83-FITC、CD86-PE、HLA-DR-FITC单抗为Burlingame公司产品.CCK8试剂盒为Dojindo,Kumamoto,Japan产品，K562细胞和骨髓瘤RPMI8266由中山大学血液病研究所惠赠。

1.2单个核细胞的分离

所采集标本得到健康志愿者本人自愿同意并签署同意书，实验通过医院伦理委员会批准。采集外周血50ml（40u/ml肝素抗凝）加等体积的PBS液稀释,具体步骤参见文献[2]，收集贴壁细胞，作为单核细胞培养DC。非贴壁细胞作为T淋巴细胞。

1.3DC培养

调整单核细胞浓度为106/ml，具体步骤参考文献[2]，根据分组分别加入稀释的卡介苗、肺炎球菌疫苗、麻疹疫苗（疫苗各组）及K562细胞、RPMI8266细胞冻溶物（肿瘤细胞组）后培养48小时。单独加入TNF-a作为单纯TNF-a组（对照组），仅仅加入相同体积培养基作为空白对照。

1.4混合淋巴细胞反应（mixedlymphocytereactionMLR）

培养成熟DCs用丝裂霉素(25μg／L)处理1h去增殖后作为刺激细胞，调整细胞浓度为106/ml后，分别与外周血分离的T淋巴细胞（2×105个／ml）在96孔平底培养板中混合培养5天(DC：T细胞分别为1：100，1：50，1：10，1：1)。终体积为每孔200μl，对每个浓度均作4个平行孔。另设T细胞对照孔，并以同样抗原处理后的单核细胞(Mo)与T细胞共培养孔作为DC与T淋巴细胞作用的对照孔。培养第五天以CCK8法测定混合MLR，用酶标仪检测波长450nm时的吸光度(A)值，参比波长为630nm，结果取均值。算增殖指数(PI)。PI=ADC+Tcell–ADC/ATcell–Ablank。

1.5流式细胞仪（FCM）检测

DCs培养第7天，FCM测定其膜CD分子表达调节。取细胞悬液100μl/管（细胞浓度为1×106/ml），分别加入相应单克隆抗体各15μl，混匀后置室温下暗室反应30min，离心、洗涤、固定备作FCM测定。CellQuest软件进行分析。

1.6统计学分析

采用SPSS16.0软件，所测数据用均数±标准差（x-±s）表示，采用theStudents’Ttest。P<0.05表示有统计学意义。

2.实验结果

2.1DCs形态学

新分离的骨髓单个核细胞呈球形散在分布，表面光滑；培养48h后，培养5-7d后细胞均匀分散，进一步变形，体积增大，胞浆丰富，具有典型DC形态。各组形态学在光学显微镜下观察未见明显差异。见图1。

图1树突状细胞培养。培养第一天（左侧），第5天（右侧）

2.2DCs免疫表型

各组第7天DCFCM测定免疫表型，HLA-DR、CD80、CD86、CD11c均高表达，未见明显统计学差异，P＞0.05。卡介苗、肺炎球菌及麻疹疫苗组CD83较其他各组明显升高，差异有统计学意义，P＜0.05，K562细胞组、RPMI8266细胞组较单纯TNF-a组及空白对照组CD83表达升高，差异亦有统计学意义，P＜0.05。疫苗各组及肿瘤细胞各组之间比较差异未见统计学意义，P＞0.05。各种抗原刺激组CD1a较单纯TNF-a及空白对照组下降，差异有统计学意义，P＜0.05。表1。

2.3MLR

DC刺激淋巴细胞增殖指数(PI)能力呈数量依赖性，其中卡介苗、肺炎球菌疫苗及麻疹疫苗组等DC较其他各组MLR增强，差异有统计学意义，P＜0.05。K562及RPMI8266细胞组较单纯TNF-a及空白对照组亦明显增强，差异有统计学意义，P＜0.05，但疫苗各组及肿瘤细胞各组间比较无统计学差异，P＞0.05，见图2。

图2混合淋巴细胞反应（MLR）。

3.讨论

DC是唯一一类可直接活化静息T细胞的APCs，多种抗原通过DC递呈抗原激活Na?veT细胞[3]。一般递呈外源性抗原例如微生物抗原通过MHC-II类分子，使Na?veT细胞向CD4+T细胞方向发展，递呈内源性抗原如肿瘤抗原通过MHC-类分子，使Na?veT细胞向CD8+T细胞方向发展，发挥CTL（细胞毒性T细胞）效应[2][4]。本研究中以GM-CSF、IL-4、TNF-a等细胞因子联合或不联合各种抗原处理末梢血中的单核细胞,培养5～7d后细胞均具有典型树突状突起细胞形态，FCM证实具有典型的DC免疫学表型，成熟标志CD83阳性，且MLR实验提示T淋巴细胞在DC作用下明显扩增，呈剂量依耐性，提示该DC是有功能的DC。以上实验结果证明各组细胞均被培养为有功能的成熟DC。

成熟DC不具有抗原吞噬和处理作用，但具有很强的抗原提呈能力和与T细胞相互作用的能力，不需要CD4辅佐细胞就能诱导CD8细胞增殖和CTL反应[5]。目前应用细胞因子成功培养出不同来源(脐血、健康人、慢粒患者外周血)的DC，通过TNF-α等细胞因子及联合多种抗原促进DC成熟。资料显示使用卡介苗等多种疫苗及经CML冻融抗原刺激后的DC能表现出强于未刺激的特异性CTL效应[2]；应用干扰素联合传统细胞因子，可以诱导出CML患者来源DC的成熟。本研究结果提示微生物抗原联合TNF-α促进DC表达CD83最高，其MLR效应最强，提示微生物抗原联合TNF-α促DC成熟作用最强，而K562、RPMI8266肿瘤细胞抗原作用其次，均较单纯TNF-α作用强。不成熟DC诱导免疫耐受，导致抗肿瘤效应无能[6]。因此，在DC肿瘤疫苗研究中，诱导成熟DC是一个重要问题。本研究提示微生物抗原联合肿瘤抗原可能更有效促进DC成熟。

【参考文献】

[1]MartinK,SchreinerJ,ZippeliusA.ModulationofAPCFunctionandAnti-TumorImmunitybyAnti-CancerDrugs[J].FrontImmunol,2015,29;6:50.

[2]FTian,Jli,YLietal.Enhancementofmyelomadevelopmentmediatedthoughmyelomacell-Th2cellinteractionsaftermicrobialantigenpresentationbymyelomacellsandDCs[J].BloodCancerJournal(2012)2,e74;doi:10.1038/bcj.2012.19.

[3]BernerVK,duPreSA,RedelmanD,etal.Microparticulateβ-glucanvaccineconjugatesphagocytizedbydendriticcellsactivatebothna?veCD4andCD8Tcellsinvitro[J].CellImmunol.2015Nov2.pii:S0008-8749(15)30030-7.doi:10.1016/j.cellimm.2015.10.007.[Epubaheadofprint]

[4]MartinK,SchreinerJ,ZippeliusA.ModulationofAPCFunctionandAnti-TumorImmunitybyAnti-CancerDrugs[J].FrontImmunol.2015Sep29;6:501.

[5]HawigerD,InabaK,DorsettY,etal.DendriticcellsinduceperipheralTcellunresponsivenessundersteadystateconditionsinvivo[J].JExpMed,2001;194:769-79.

[6]BloyN,PolJ,ArandaF,etal.Trialwatch:Dendriticcell-basedanticancertherapy[J].Oncoimmunology.2014Dec21;3(11):e963424.eCollection2014.

基金项目：

深圳市科技创新项目科技研发基金No.JCYI20140414123738256；深圳市龙岗区科技发展基金No.YLWS20150514150041453。