MicR-370在高频脉冲电磁场下对骨髓间充质干细胞调控作用的初步研究

MicR-370在高频脉冲电磁场下对骨髓间充质干细胞调控作用的初步研究

郭杰苏伟黄钊谢能峰何肖丞

郭杰苏伟黄钊谢能峰何肖丞

（广西医科大学第一附属医院创伤骨科中心广西南宁530021）

【摘要】目的：通过检测>380MHz高频脉冲电磁场刺激下骨髓间充质干细中microRNA-370的表达变化规律，探讨mir-370对骨髓间充质干细胞可能的影响。方法：采用贴壁筛选法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，取第3代细胞随机分为两组：电磁场照射组、空白对照组，分别提取总RNA通过Realtime-PCR的结果推测mir-370对大鼠间充质干细胞中的bmp-7的调控作用。结果：经全骨髓细胞贴壁筛选法分离培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞符合大鼠骨髓间充质干细胞基本特征。大鼠基因组模板Bmp7已扩增出来，大小与预测一致。在转染克隆有BMP7基因3’UTR质粒的实验组中，mimics组与空白组和NC组相比，（P>0.05）无统计学差异，证明mir-370不能与BMP7基因3’UTR结合，影响萤光素酶的活性。结论：mir-370不能负向调控bmp-7蛋白从而到达抑制骨髓间充质干细胞的作用。

【关键词】小分子RNA骨髓间充质干细胞高频脉冲电磁场调控定量聚合酶链式反应

【中图分类号】R68【文献标识码】B【文章编号】2095-1752（2013）10-0386-04

【Abstract】[Objective]:>380MHzhigh-frequencypulsedelectromagneticfields(HF-PEMFs)stimulationbydetectingbonemarrowmesenchymalstemcells(BMSCs),microRNAs-370(mir-370)expressionvariationexploremir-370onBMSCsmay.[Methods]:adherencescreeningmethodisisolatedandculturedSDratBMSCs,the3rdgenerationcellswererandomlypidedintotwogroups:theelectromagneticfieldradiationgroup,blankcontrolgroup,respectively,totalRNAwasextractedbyRealtime-PCRresultsspeculatemir-370regulationofbmp-7inratmesenchymalstemcells.[Results]:adherencescreeningmethodofwholebonemarrowcellswereisolatedandculturedinSDratBMSCsinlinewiththebasiccharacteristicsofratBMSCs.TheratgenomeamplifiedtemplateBmp7out,sizeandforecasts.ClonetransfectedtheBMP7gene3'UTRplasmidexperimentalgroupMimicsthebestchoicegroupcomparedwiththecontrolgroupandtheNCgroup,(P>0.05)wasnotstatisticallydifferent,andthatmir-370cannotbecombinedwithBMP7gene3'UTRaffecttheactivityoftheluciferase.[Conclusion]:mir-370isnotsuppressionofBMSCstoreachthenegativeregulationofbmp-7protein.

【Keywords】smallmoleculeRNA;Bonemarrowmesenchymalstemcells;high-frequencypulsedelectromagneticfields;regulation;Quantitativepolymerasechainreaction

引言

骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)是存在于骨髓基质系统中的一种组织干细胞，具有自我更新能力和多向分化潜能，可分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞、成肌细胞、内皮细胞、神经细胞等类型的细胞，是组织工程理想的种子细胞来源[1]。本实验前期工作证明，高频脉冲电磁场(High-FrequencyPulsedElectromagneticFields，HF-PEMFs)[2]能够对大鼠骨髓间充质干细胞(BoneMarrowMesenchymalStemcells，BMSCs)的增殖和诱导成骨产生抑制作用。骨形成蛋白-7（BMP-7)又称成骨蛋白-1(OP.1)，是骨形态发生蛋白家族中的成员，具有广泛的生理功能及良好的诱导成骨的能力。小分子RNA（microRNA）[3]是一组由约为20—24个核苷酸组成的非编码小分子RNA，它们参与机体的各种重要的生理和病理过程，近十年来的研究发现microRNA在细胞的增殖、分化、和凋亡等多种生命活动中发挥着重要作用。

1材料与方法

1.1设计：随机对照细胞培养观察实验。时间及地点：于2010年12月至2011年8月在广西医科大学基础实验中心104馆完成。

1.1.1实验动物：选取雄性，3周龄，体重约为50—60gSPF级的SD大鼠，由广西医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（桂）2009-0002。

1.1.2实验所需仪器及试剂：CO2培养箱（THERMO），AIR-TECH型生物洁净工作台(苏净集团安泰公司)，倒置相差显微镜（Olympus公司），高频电磁场发射器：BF5118对讲机，三轴式电磁波测试仪（TES-1394，台湾泰仕）。-20℃低温冰箱（海尔公司）-20℃低温冰箱（海尔公司），制冰机（AngelantoniIndustrie公司），-80℃超低温冰箱（Formascientific公司），GIBCO公司：L-DMEM培养基、H-DMEM培养基、D-Hank’s液、胎牛血清；Sigma公司：青霉素、链霉素、胰蛋白酶、地塞米松。cDNA反转录试剂盒（Fermentas公司），TRIZOLReagent(Invitrogen,US)，RT-PCR引物(由上海Invitrogen公司合成),PrimerScriptRTreagentKit(TaKaRa),SuperRealPreMix(SYBRGreen),microRNA-370[广州莱德尔生物科技有限公司（港资）构建],Dual-LuciferaseReporterAssaySystem（E1910）(Promega公司),DNA凝胶回收试剂盒(DONGSHENGBIOTECH),SYBRGreenPCRMasterMix(TOYOBO公司)。

1.2方法

1.2.1BMSCs的原代分离培养及传代[4]:

选用SPF级（健康洁净级）3周龄健康雄性SD大鼠，以颈椎脱臼法处死大鼠并立即将其浸入75%乙醇中10min，进行消毒。无菌条件下取大鼠双侧股骨、胫骨。移入无菌1×PBS液洗涤骨三遍。用眼科剪将骨干中部剪断，5ml注射器吸取无血清L-DMEM基础培养液从骨髓腔中冲洗出骨髓，反复冲洗至骨髓腔变成白色为止，吸管反复吹打骨髓液成细胞悬液，去除滤渣。收集滤液移入10mL离心管中，1000r/min，5min，离心，弃去上清液。加含有10%胎牛血清L-DMEM培养液，吸管吹打成均匀的骨髓细胞悬浮液。10%胎牛血清的细胞悬液移至显微镜下计数板计数，调节细胞密度至5×108。分别接种细胞悬液8ml到底面积为100cm2玻璃培养瓶，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的恒温培养箱中培养。48h后换液，倒置显微镜观察细胞形态。当原代细胞生长铺满100cm2塑料培养瓶底的>90%时，予传代培养。吸出培养液，37℃的1xPBS液15ml清洗2次，加入0.25%胰酶消化液3ml(不含EDTA）。将培养瓶放入CO2培养箱中消化2分钟，用5ml含10%胎牛血清L-DMEM基础培养液终止胰酶消化，使细胞充分震荡脱离培养瓶底，然后用无菌吸管将培养液吸出移入离心管中，以1000r/min常温下离心5min，再移入超净工作台中将离心管中上清液吸出，再加入适量含有10%的FBS的L-DMEM制成细胞悬液，再次离心5min，弃上清，加入含有10%的FBS的L-DMEM制成细胞悬液，吹打悬浮BMSCs均匀后计数，以1×106／cm2浓度传代至底面积100cm2培养瓶中（P1），并置于37℃、体积分数5%CO2、95%空气的培养箱内培养，每48h更换培养液，传代后7天细胞铺满瓶底90%，此时细胞可再次传代（P2）提纯。如此一直传代BMSCs到第三代（P3），均按1：3比例传代。每日均在40及100倍倒置显微镜下观察细胞的生长情况及形态特征。P3代大鼠骨髓间充质干细胞高频脉冲电磁场干预：选取P3代细胞作为本实验的靶细胞，将P3代大鼠骨髓间充质干细胞随机分为A、B两组（A组为干预组，B组为空白对照组）。自制高频脉冲电磁场发射器：BF5118对讲机发射电磁场。（仪器参数：380MHz、正弦波形、功率5W、20cm内，对A组细胞进行照射，2次/d，30min/次，两次间隔12h。倒置相差显微镜分别观察两组细胞形态、数量。

1.2.2大鼠骨髓间充质干细胞总RNA的提取：

贴壁细胞培养诱导结束后，移除培养液；加入适量的1xPBS缓冲液快速冲洗一次，彻底去除PBS缓冲液；每10cm2细胞加1mLTRIzol；使用1mL移液器Tip头反复多次吹打细胞，直至细胞充分溶解至无絮状物为止；将裂解液转移至RNase-free的离心管中。将所抽取的RNA作为实验对象放入-80℃冰箱中保存待用。

1.2.3茎环法检测miR-370:

选择高频干预组和空白对照组RNA进行miR-370的检测。茎环法逆转录的反应体系和反应条件，在去RNase的PCR管中配置总体积为12μL溶液包含：totalRNA1.0μg，去离子水11μl；将上述溶液混匀，85℃孵育5min，以打开RNA二级结构。随后立即置于冰上，以防止RNA复性再次恢复二级结构。在另一去RNase的PCR管中配置总体积为8.0μl溶液包含：dNTP2.0μL、RNase0.5μL、miR-370逆转录引物0.5μL、U6逆转录引物0.5μL、5xbuffer4.0μL、M-MLV0.5μL；将上述两种溶液混匀后42℃孵育60min；85℃孵育10min灭活逆转录酶。

1.2.4定量PCR：

反应体系总体积为20μL，包括:cDNA（1:20）5.0μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、2xSYBRGreenPCRMasterMix10μL、去离子水4μL。反应条件：95℃热启动10min；95℃变性15S，65℃退火15S，72℃延伸10S，72℃收集荧光，共40个循环；55～95℃每上升1℃收集一次荧光。实验设置3个平行复孔，取平均值。

1.2.5bmp-7构建与扩增：

1)根据Gen-Bank中报告基因序列，设计合成扩增引物，其中Bmp7XhoIF:5'ccgctcgagGTCTTCCTGAGACCCTGACCTTTTG3'，Bmp7NotIR:5'ataagaatgcggccgcCGCCTCCCTCCACCTTCACC3'；2)PCR钓取基因；3)PCR回收产物及载体双酶切；4)酶切产物回收（DNA凝胶回收试剂盒，DONGSHENGBIOTECH）；5)目段片段与载体连接；6)连接产物的转化；7)质粒酶切鉴定阳性克隆；8)选取Bmp7-2号质粒去测序。

1.2.6miR-370靶向调节基因功能鉴定:

microRNA与质粒共转染细胞。Lucifersae检测:用Promega公司的Dual-LuciferaseReporterAssaySystem（E1910）进行样品Luciferase活性检测。转染48h后，吸去旧的培养基，用PBS清洗洗两次，每孔细胞加入100μL的PLB（PassiveLysisBuffer），室温轻微振摇15分钟，收集细胞裂解液。1、使用手动的双萤光检测仪（Promega，GloMax生物发光检测仪）检测,保存数据。2、使用自动发光检测仪进行检测，保存数据。

2结果

2.1总RNA纯度和完整性检测：纯度检测：取1μlRNA样品50倍稀释，在BioPhotometerplus艾本德核酸蛋白测定仪上测定OD值，OD260/OD280的比值大于1.8，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。总RNA完整性检测：取RNA样品1μl，1％琼脂糖凝胶电泳80V×20min，用凝胶成像系统观察总RNA的5srRNA，18srRNA和28srRNA条带，三条条带完整即可证明总RNA抽提比较完整。见图1。

Lane1为11251BH对照组RNA11.6.16，Lane2为11251BH刺激组RNA11.6.16，Lane3为11251-2BH对照组纯RNA11.7.13，Lane4为11251-2BH对照RNA11.7.13.

2.2选取图一所示中的Lane1空白对照组和Lane2高频干预组进行miR-370定量PCR检测。结果见图2。

2.3Bmp7用大鼠基因组模板已扩增出来，大小与预测一致，泳道1红色箭头所示（扩增条带在Marker750bp左右）；证明Bmp7目的基因已扩增出来。见图3。

泳道1：Bmp7PCR扩增产物(728bp)；

泳道M：DL2000DNAMarker；

泳道M：DL2000DNAMarker；

泳道1-2：分别为Bmp7-1的质粒与酶切后产物；

泳道3-4：分别为Bmp7-2的质粒与酶切后产物；

泳道5-6：分别为Bmp7-3的质粒与酶切后产物；

泳道7-8：分别为Bmp7-4的质粒与酶切后产物；

2.4酶切产物以含溴化乙锭（EB）的1％琼脂糖凝胶电泳分离，UVP凝胶成像系统成像。见图4

2.5选取图4中Bmp7-2号质粒去测序，测序结果进行BLAST分析：基因Bmp7已成功克隆至psiCHECK-2载体中，与NCBI上已知序列进行BLAST完全一致。见图5。

2.6miR-370靶向调节基因功能鉴定结果：在转染克隆有BMP7基因3’UTR质粒的实验组中，mimics组与空白组和NC组相比，P>0.05无统计学差异，证明miR-370不能与BMP7基因3’UTR结合，影响萤光素酶的活性。在转染克隆有Psicheck2基因3’UTR质粒的实验组中，miR-370组与空白组和NC组相比,P>0.05无统计学差异，证明miR-370不能与psiCHECK2空载结合，影响萤光素酶的活性。P值计算见表1，实验结果见图6。

3讨论

近年来由于创伤、骨病、骨肿瘤等所致的大量骨缺损已经成为临床工作中面临的一大难题，BMSCs作为骨髓基质的干细胞具有多向分化潜能，而且其来源广泛、易于提取、和体外培养稳定的优点使BMSCs成为组织工程中最有应用前景的种子细胞之一。也正因为如此，通过体外培养间充质干细胞为我们解决大量骨缺损这样的临床难题开启了另一扇窗。然而目前对BMSCs的定向分化和增殖调控尚缺少有力的证据，如何在分子生物学基础上找到BMSCs的调控因子使其在分化和增殖的生物学过程中能够人为的进行有效的干预，从而更精确的控制BMSCs的分化将更具有临床价值。

根据许圣荣等[5]研究表明P1、P2代BMSCs存在部分混杂细胞，并且总体细胞数量有限，而P5代以后的细胞又逐渐出现细胞衰老，增值减慢的现象，研究发现P3代BMSCs具有良好的细胞活性，且细胞的数量可以满足实验所需总RNA的要求，加之本实验前期工作证明高频脉冲电磁场能够BMSCs的增殖和诱导成骨产生的抑制作用。因此本实验选择P3代BMSCs作为高频脉冲电磁场干预组进行实验研究。

骨形成蛋白-7（BMP-7)又称成骨蛋白-1(OP.1)，是骨形态发生蛋白家族中的成员，具有广泛的生理功能及良好的诱导成骨的能力。作者根据Gen-Bank中报告基因序列，设计合成扩增引物，成功构建与扩增了bmp-7蛋白，并选取Bmp7-2号质粒去测序其测序结果进行Blast比对与NCBI上已知序列进行BLAST完全一致，符合其作为载体进行mir-370检测的要求。

1996年美国AppliedBiosystems公司推出实时定量荧光PCR技术[6]以来实现了PCR从定性到定量的飞跃，使分子生物学的研究有了质的提升，使其更具有特异性，且自动化程度更高，有效的解决了PCR研究中普遍存在的污染问题，目前已得到普遍认可和应用。microRNA是一种大约由22种核苷酸组成的单链小RNA，其广泛存在于真核生物中，由于其长度太短传统的PCR技术很难检出，但是通过特殊设计的茎环结构的反转录引物实配合使用时定量PCR引物及探针可以精确地检测实验样品中microRNA的表达水平。本实验通过运用反向遗传法[7]利用广州莱德尔生物科技有限公司的microRNA-370模拟物（microRNA-370mimics），microRNA-370阻碍物（microRNA-370inhibitors），转染进入bmp-7进行Lucifersae检测。

本实验的研究表明：在转染克隆有BMP7基因3’UTR质粒的实验组中，mimics组与空白组和NC组相比，均无统计学差异，证明mir-370不能与BMP7基因3’UTR结合，影响萤光素酶的活性。在转染克隆有Psicheck2基因3’UTR质粒的实验组中，microRNA-370组与空白组和NC组相比也均无差异，证明microRNA-370不能与psiCHECK2空载结合，影响萤光素酶的活性。因此，microRNA-370转染bmp-7蛋白并不能起到负向调控其生物学作用从而到达抑制骨髓间充质干细胞增殖的作用。本实验通过通过检测>380MHz高频脉冲电磁场刺激下骨髓间充质干细中microRNA-370的表达变化规律，探讨microRNA-370对骨髓间充质干细胞成骨可能的影响，实验结果虽然未能证明microRNA-370对BMSCs的负向调控机制，但通过该方向的研究证实了microRNA-370对BMSCs的无效性，为今后该方向的后续实验研究提供了一定的参考意义。

参考文献

[1]PittengerMF,MackayAM,BeckSC,etal.Multilineagepotentialofadulthumanmesenchymalstemcells[J].Science,1999,284(5411):143-7.

[2]崔向荣,苏伟,黄钊,etal.高频脉冲电磁场对骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,15(10):

[3]BartelDP.MicroRNAs:targetrecognitionandregulatoryfunctions[J].Cell,2009,136(2):215-33.

[4]CelebiB,ElcinYM.Proteomeanalysisofratbonemarrowmesenchymalstemcellsubcultures[J].Journalofproteomeresearch,2009,8(5):2164-72.

[5]许圣荣,赵劲民,苏伟.骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究[J].广西医科大学学报,2010,27(5):

[6]FengJ,WangK,LiuX,etal.ThequantificationoftomatomicroRNAsresponsetoviralinfectionbystem-loopreal-timeRT-PCR[J].Gene,2009,437(1-2):14-21.

[7]AmbrosV.ThefunctionsofanimalmicroRNAs[J].Nature,2004,431(7006):350-5.

基金声明：国家自然科学基金资助项目(30860078)；广西壮族自治区教育厅科研项目(200710MS021)及广西医科大学第一附属医院科研基金项目。