肌酐酶法测定的两点法

肌酐酶法测定的两点法

李兰

李兰(四川省新津县人民医院611430)

【摘要】建立了实用的肌酐酶法测定方法,通过实验将比色测定终点法改为两点法,使其适合自动分析，并节省工具酶。本法的线性为0～2749Μmmol/L，精密度：手工操作，批内CV<3%,总CV<5%。三种分析仪的批内CV在0.34%～1.44%间，回收率99.66%～100.9%。本法(Y)和BM的试剂(X)比较：Y=0.973X+10.33Μmol/L,r=0.9995。

【关键词】肌酐酶法两点法

【中图分类号】R446【文献标识码】B【文章编号】2095-1752（2013）35-0355-02

酶法测定肌酐目前已报告的有四条途径[1～5]，其中三种为紫外测定，一种为比色测定。相比之下比色测定具有更多优越性，商品试剂盒多采用此法。但Fossati原法[1，2]的反应时间较长，且要做一血清空白以除去血清中肌酸的干扰，因此不适合自动分析。自动分析一般总反应时间为10分钟，为了除去肌酸的干扰必须采用两步法，反应要求5分钟内达到终点。据我们实验，必须将几种工具酶的用量增加到Fossati原法的5～10倍。在实验过程中我们还发现几种工具酶的水解速率均较缓慢，反应的线性时间较长，因此将其改成两点法或速率法测定，取得很好的结果。

1原理

第一步反应：排除肌酸干扰;

第二步反应：测定肌酐;肌酸反应同第一步。

2材料和方法

2.1仪器自动分析仪HITACHI7170,BeckmanSynchron△CX5和CibaCoringExpressPlus。分光光度计BeckmanDU-640。

2.2原料试剂肌酐酰氨基水解酶(Cretininase,CRNase);肌酸脒基水解酶(Creatininase,CRTase);肌氨酸氧化酶(SO)；棘根过氧化物酶(POD)，抗坏血酸氧化酶(ASO)，均为BoehringerMannheim公司产品。3，5-二氯-2-羟-苯磺酸(DHBA)，4-氨基安替比林(4-AAP)和肌酐为Sigma公司产品。

2.3应用试剂试剂Ⅰ：每L磷酸盐缓冲液(150mmol/L,pH7.5)中含CRTase20kU,SO6kU,POD1kU,ASO1kU,DHBA3mmol,K4Fe(CN)620Μmol,和4-AAP4mmol。试剂Ⅱ：每L含CRNase50kU。参考物(177Μmmol/L):精确称取肌酐20mg溶于1L经透析的混合血清中。

2.4测定方法自动分析通用参数：反应类型：两点法，反应温度：37℃，波长500～520nm(主)/650nm(次)；标准：15Μl;样品：15Μl;试剂Ⅰ：200Μl;孵育时间300秒；试剂Ⅱ：50Μl;第一点读数时间：120秒，第二点读数时间300秒。

2.5比较方法BoehringerMannheim的肌酐酶法测定试剂盒，按说明书测定。

3实验和结果

3.1去除肌酸干扰的能力选择肌酐含量为495Μmol/L的样品一份,分别加入肌酸34,67,101,134Μmol/L用本法测定,结果分别为497.6,495.8,492.7,489.1Μmol/L,说明通过第一步反应至少能去除134Μmol/L的肌酸。

3.2反应动力学曲线选择不同浓度的样品按测定方法中的参数将样品和试剂Ⅰ混匀，37℃水浴300秒，然后加入试剂Ⅱ，立即于BeckmanDU-640分光光度计自动记录动力学曲线（图略）。说明样品浓度在2740Μmol/L(31mg/dl)以下时120～300秒间呈线性。在此时间内可以用两点法测定。

3.3线性范围按NCCLS(EP6-P)的评价方案,选择低值(97Μmol/L)和高值(2749Μmol/L)样品各一份等量混匀产生中间值,再分别将中间值和低值、中间值和高值等量混匀,共产生5个不同值,用三种分析仪分别用两点法从低值到高值,然后从高值到低值测定,求得均值为Y,以理论值为X,进行回归分析，三种仪器的回归方程如下,Hitachi7170:Y=0.9912X+9.55,r=0.9999；BeckmanCX5:Y=1.0799X-32.56，r=0.998；Ciba-Coning:Y=0.997X-39.4，r=0.9987。均有很宽的线性范围。

3.4精密度按NCCLS(EP5-T2)的评价方法，选择88.7和752.3Μmol/L的样品各一份，用BeckmanDU68分光光度计每天上下午双份测定，测10天。结果：批内CV2.73%和0.71%；批间CV4.43%和2.93%；总CV4.92%和2.73%。三种仪器二个样品的批内CV：Hitachi7170为0.38和0.34%；BeckmanΔCX5为1.44和1.31%以及Ciba-Coring为0.58和0.43%。

3.5回收率选择肌酐含量82.7Μmol/L的混合血清一份，分别加入221，442和884Μmol/L用本法测定，回收率在99.66%～100.9%。

3.6方法比较按NCCLS(EP9-P)的评价方案，选择含量在35～2655Μmol/L间的临床样品40份，分别用本法(Y)和BM公司的试剂盒(X)测定，结果X=411.1Μmol/L,Y=410.2Μmol/L,Y=0.973X+10.33Μmol/L,r=0.9995。二者有良好相关。

3.7参考值测定选择健康体检样品275份(其中男183份，女92份)，年龄在23～60岁。列入统计者均无肾病史，肾功能检验均正常。在BeckmanCX5分析仪上用本法测定,结果：男子±s为98.4±18.9Μmol/L,范围为60.6～136.2Μmol/L,女子±s为77.8±16.5Μmol/L,范围为44.8～110.8Μmol/L。

4讨论

4.1据报告，肌酐酶法测定有四条反应途径[1～5](图略)。我们选择比色测定是因为其灵敏度较高，线性范围宽，几种工具酶的稳定性较好[6]。

4.2酶法测定肌酐的特异性远优于Jaffe氏法，血清中的内源性肌酸可用二步反应清除，我们在反应体系中加入亚铁氰化钾和抗坏血酸氧化酶以消除Trinder反应中的胆红素和维生素C的干扰。

4.3工作试剂保存在4℃至少可稳定一个月，但在保存过程中工具酶或其它组份的少许变动均可影响反应速率，因此要求每天定标。

参考文献

[1]杨芳芳,杨晓东.宜昌地区血清肌酐酶法参考区间调查[J].国际检验医学杂志.2013年04期

[2]马鸿娟,刘胜林.两种肌酐测定在全自动生化分析仪上的应用及评价[J].哈尔滨医药.2006年06期

[3]华永川,金斐,吕国才,娄域峰,徐根云.肌酐酶-肌氨酸氧化酶法测定血清肌酐[J].

[4]华中医学杂志.2004年01期

[5]唐金玉,崔四放,李海林.CEMBHCL为色原的酶法测定血清肌酐试剂盒的评价[J].包头医学院学报.2011年01期、

[6]蒙开喜.血清肌酐测定方法的研究[J].中外医疗.2009年05期