HPLC法检查甲睾酮片的有关物质

HPLC法检查甲睾酮片的有关物质

吴孟岚杨进

吴孟岚杨进

（黔东南州食品药品检验检测中心；贵州凯里556000）

摘要：目的探讨甲睾酮片有关物质检查方法。方法采用采用高效液相色谱(HPLC)法,色谱柱为C18柱(150mm×4.6mm,5μm);以甲醇-水(68：32)为流动相;检测波长288nm;柱温30℃;流速1.0ml?min-1。结果在选定的色谱条件下,主成分与有关物质能完全分离,各杂质峰分离良好。结论该方法专属性强、灵敏度高、重复性好,可用于检查甲睾酮片的有关物质。

关键词：甲睾酮片有关物质高效液相色谱法

甲睾酮为人工合成的甾类激素,具有促进男性性器官及副性征的发育成熟、对抗雌激素和促进蛋白质合成与骨质形成等作用，化学名称为17α-甲基-17β-羟基雄甾-4-烯-3-酮。甲睾酮片近几年来临床无不良反应的报道，但通过检索文献发现服用甲睾酮片有过敏反应的情况，而且17-α-烷基类的激素一般都有肝损伤。为有效控制产品质量，对其有可能存在的杂质进行研究，考察甲睾酮片的有关物质。

1实验部分

1.1仪器与试药

高效液相色谱仪（日本岛津SIL-20A），甲睾酮对照品（100172-200503，中国药品生物制品检定所），甲睾酮片，甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。

1.2方法与结果

1.2.1色谱条件与系统适应性试验

十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（68：32）为流动相；检测波长为288nm；理论塔板数按甲睾酮计不低于1500，甲睾酮峰与相邻峰的分离度均符合要求。

1.2.2溶液的制备

取甲睾酮片10片，研细，加甲醇溶解并稀释制成每1ml中约含0.6mg的溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液；精密量取供试品溶液2ml，置100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为对照溶液。取不含甲睾酮的空白对照适量,按供试品制备方法制成阴性对照溶液。

1.2.3专属性

在“1.2.1”项的色谱条件下，精密量取甲睾酮对照品溶液、空白对照溶液、供试品溶液各10μl,分别进样,记录色谱图。由图1可知,原料药杂质峰、辅料峰、主成分峰均能完全分离,辅料无干扰。

图1阴性对照溶液（A）、甲睾酮对照品溶液（B）、供试品溶液（C）

精密量取2ml供试品溶液4份,分别进行如下操作:加5ml甲酸溶液,在100℃水浴中加热50min;加5ml氨水,在60℃水浴中加热30min;加5ml30%过氧化氢溶液,在100℃水浴中加热50min;在100℃烘箱中加热8h。将以上各破坏样品稀释制成0.6mg?ml-1的降解溶液。照“1.2.1”项下的色谱条件,精密量取10μl上述降解溶液,分别进样,记录色谱图。由图2可知,各破坏试验产生的降解产物峰均能与主成份峰完全分离。

图2供试品未破坏（A）、酸破坏（B）、碱破坏(C)、氧化破坏（D）、高温破坏（E）

1.2.4检测限与耐用性试验

取供试品溶液,用甲醇稀释成系列浓度,进样,当S/N=3时,测得检测限为0.06ng[2]。在“1.2.1”项色谱条件的基础上,对流动相的组成、流速、柱温、同类型不同品牌的色谱柱进行耐用性试验。结果表明,当系统条件发生微小变动时,测定结果不受影响。说明本法的耐用性良好,符合测定要求。

1.2.5有关物质的测定

照“1.2.1”项下的色谱条件,取10μl对照品溶液进样,调节检测灵敏度,使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20%,精密量取供试品溶液与对照溶液各10μl,分别进样,记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积（2.0%），各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的1.5倍（3.0%）。供试品溶液色谱图中任何小于对照溶液主峰面积的0.025倍的峰可忽略不计。

对34批样品的有关物质进行了检查，结果见表1。

表1甲睾酮片有关物质检验结果

2讨论

2.1试验中用LC-MS-MS分析了甲睾酮片中的杂质，通过LC-MS-MS对甲睾酮片及原、辅料的研究发现其有m/z301.4的杂峰，用DAD对原、辅料进行分析，辅料在241nm波长下对杂质测定存在干扰，m/z301.4的杂峰在288nm处有最大吸收且辅料干扰较弱。故HPLC的检测波长确定为288nm。

2.2《中国药典》2015年版二部甲睾酮原料药有关物质的方法中流动相为甲醇-水（72:28）[1]，该流动相比例m/z301.4的杂峰无法与甲睾酮主峰达到很好的分离，经过试验分析将流动相比例改为甲醇-水（68：32），能有效分离m/z301.4的杂峰。故HPLC的流动相比例确定为甲醇-水（68：32）。

2.3破坏结果表明,甲睾酮对酸、氧化等因素较稳定;对碱、热等因素较敏感。

参考文献

[1]中华人民共和国国家药典委员会.中国药典[S].二部.北京:中国医药科技出版社,2015.222.

[2]陈霞,冉兰,陈良.HPLC梯度洗脱法检查甲睾酮喷雾剂中的有关物质[J].华西药学杂志,2009,24(4):421-422.