浅谈艾滋病筛查实验室质量控制及问题分析

浅谈艾滋病筛查实验室质量控制及问题分析

谌模武白新民

谌模武白新民（江西省南昌县疾病预防控制中心江西南昌330200）

【中图分类号】R512.91【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2010)17-0014-03

【关键词】质量控制HIV抗体初筛

质量控制是指在每一次实验过程中为保证实验工作的正常进行而必须的各种措施。为了保证HIV抗体初筛检测结果的正确性和准确性，除按照《全国艾滋病检测工作规范》[1]立起合格的初筛实验室外，更重要的是建立一个全面的质量控制体系，并严格地按此体系运行。我中心2007年取得HIV抗体初筛检测资格，我一直在本中心HIV抗体初筛实验室工作，积累了一些经验，发现并解解了一些问题，且建立了一套较完备的质量控制体系，从而保证了HIV抗体初筛检测结果的正确性。现谈谈如何做好艾滋病筛查实验室质量控制和艾滋病筛查实验室中的问题分析。

1实验室的质量保证

1.1实验室的规范建设

应按《全国艾滋病检测工作规范》要求建立起合格的初筛实验室，设置清洁区、半污染区、污染区，符合二级生物实验室（BSL-2）的要求。

1.2人员

实验室要求有3名以上技术人员，其中具有中级卫生技术职称人员至少1名，并具有2年以上血清学检验工作经验。实验室工作人员上岗前必须接受省级技术培训并获得合格证书持证上岗。在工作中要求每年接受省级复训一次。实验室管理人员对实验室检验人员定期作出评价，包括工作的准确性、工作效率、操作的安全性和职业道德。不建议经常更换操作人员。

1.3仪器校准和正常运转

实验室所需仪器设备应包括：酶标仪、洗板机、移液器、离心机、水浴箱、普通冰箱、-20℃冰箱、生物安全柜、高压灭菌器、定时钟、温湿度计、实验室恒温设备（空调）和生物安全防护用品。

1.3.1酶标仪检查、清洗滤光片，如果出现破裂或霉变点则要更换。根据仪器内具有的校准程序或使用校准板，对滤光片的精密度进行校准并保留记录，必需由其计量局检定，一年一次。使用时检查试剂参数设置是否和说明书一致，空白、阴阳性对照、质控品放的位置是否和原始记录一致。

1.3.2洗板机每次试验前检查洗板机管道是否通畅，是否有漏液现象。检查洗涤时各孔是否与相应的冲洗头对位良好，负压是否符合规定要求。

1.3.3移液器1年至少标定一次，如有异常情况应进行校准，必需由其计量局进行校准，1年至少标定一次，如有异常情况应进行校准，必需由其计量局进行校准,校准多道移液器时，必须保证没一个加样头都能够连续、准确地加样。移液器的精密度应在厂家说明书规定的范围内。使用完后应调至最大刻度从而保证移液器准确度和使用寿命。

1.3.4水浴箱、普通冰箱、-20℃冰箱必须每天检查和记录水浴箱、普通冰箱和-20℃冰箱的温度，并做好记录。水浴箱在孵育前需用温度计测水温是否达到37℃；冰箱要定期除霜。

1.3.5定期检查其它仪器设备其它仪器设备也应定期检查并做好记录，所有用于艾滋病筛检检验的仪器设备均须遵循清洁、保养、维修和操作的规范化程序，用后应填写仪器设备使用记录。

1.4标准操作程序（SOP）和实验室制度的制作

1.4.1标准操作程序（SOP）艾滋病筛查实验室应建立覆盖主要工作内容的SOP文件，所有程序要符合实验室情况，SOP文件由各岗位工作人员起草，实验室主任审定，并定期修订，每年至少一次。所有工作人员要在从事的SOP文件上签名表示已经阅读并掌握了有关内容。

1.4.2实验室制度实验室除建立SOP文件外，还应该制定实验室制度，包括实验室管理制度，生物安全制度，档案管理制度，健康监护制度和疫情上报制度．每位实验室工作人员都应该遵守实验室各项制度，以便保证实验室工作的正常进行。

2实验前质量控制

2.1标本的采集、运送和处理

2.1.1标本的采集用一次性注射器（或真空采血管）抽取一定量静脉血，室温下自然放置1-2h，待血液凝固、血块收缩后再用3、000r/min离心15min，吸出血清备用；用加有抗凝剂的真空采血管（或一次性注射器抽取静脉血，转移至加有抗凝剂的试管），反复轻摇(防止有血凝聚)，分离血浆和血细胞备用。

2.1.2准确及时的运送标本实验室间传递的样品应为血清或血浆，除特殊情况外一般不运送全血，血清和血浆样品应在2～8℃条件下由专人运送。送检样品管上名字要与送检复查单一致,并且字迹要清楚。

2.1.3正确地处理和保存标本用于抗体检测的血清或血浆样品，应存放于-20℃以下，短期（1周）内进行检测的样品可存放于2-8℃的冰箱中。

2.2检测方法和试剂的选择应使用可靠的检测方法（一般使用ELISA方法）和敏感性搞、特异性好的试剂，不推荐混用不同厂家的试剂。

2.3做好原始记录，标明阴阳性对照、质控品和样品的确切位子，按原始记录加样。

2.4根据试剂要求正确在酶标仪上设置相关的检测参数各种试剂的参数和结果判定不一样，阴阳的上下线，Cut-off值的设定不同，有的用阴性对照的平均值加上一个系数，有的用阳性对照的平均值乘上一个系数．

3实验中的质量控制

3.1试剂准备在ELISA测定中试剂的准备最为关键的是，在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置30分钟以上后，再进行测定，以使试剂盒在使用前与室温平衡。如在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做法有可能影响后面温育时间不够的问题，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。

3.2正确加样在现在的ELISA商品试剂盒中，血清样本的加入几乎是唯一的要使用微量加样器加入样本的步骤。使用微量加样器加样必须注意的关键点是：①加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样方法所至；②在加入样本时不要使吸头碰到孔底的抗原的包被区，会产生假阴性；③按试剂要求加入同孔数的阴阳性对照，同时还要加入一孔外部对照。

3.3温育温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。通常目前国内ELISA商品试剂盒的反应温育时间为37℃30分钟-1小时，进口ELISA试剂盒则通常为37℃1-2小时才能有较完全的结合，低于1小时，可能会影响测定下限。因此，关于温育，在实际测定操作中一定要保证在设定的温度下有足够的反应时间。一般来说，加完样本和/或反应试剂后，将微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温升至37℃，需要一定的时间，尤其是在室温比较低以及非水浴的状态下，这段升温时间可能还比较长，而在实验室中，很少有人注意这个问题，通常是将微孔板一放入温箱即开始计时，这样就很容易造成实际测定中温育时间不够，弱阳性样本测不出来的问题。因此，为保证37℃下足够的温育时间，各实验室可自行确定本实验室不同季节（不同室温下）微孔板从室温拿至温箱后需要多长时间孔内温度才能达到37℃，从而适当延长板条在温箱中的放置时间。具体的做法是，用一小温度计放置板孔反应溶液中测量观察即可。

要保证好的测定效果，可采用下述简单办法来确保温育条件，即尽量采用水浴，温育中让微孔板浮于水面上，或将浸透水的沙布放入一大饭盒中成一湿盒，放于温箱中，这样就会因为板条孔底部直接与37℃水或湿布的接触，以及水浴箱或湿盒内的高温度，而使反应溶液的温度迅速与温室平衡。

3.4洗板固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术，需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中吸附的非特异成份分离开来，以保证ELISA测定的特异性。因此，洗板对于ELISA测定来说，也是极其关键的一步。洗板时因注意非离子去垢剂的使用浓度，洗板液中Tween20浓度高于0.2%，可使包被于固相上的抗原或抗体解吸附而影响试验的测定下限。同时还应注意洗板机洗板至彻底所需的次数，洗板机液体残留量大小。

3.5显色在目前的以HRP作为标记酶的商品ELISA试剂盒中，如以TMB为底物，则提供的底物为A和B两瓶应用液；如以OPD为底物，则试剂盒提供OPD片剂或粉剂，临用前配制。一般商品试剂盒显色反应条件为37℃或室温反应15～30分钟。从理论上说，37℃30分钟才可以使HRP的底物催化反应完全，尽管在最初的10分钟内，绝大部份催化反应即可完成。因此，为使弱阳性样本孔能有充分的显色，建议在37℃下反应25～30分钟后，终止反应比色测定。在加入底物开始显色反应前，最好是先检查一下底物溶液的有效性，即可将A和B两种液各加一滴于清洁的空板孔或eppendorf管中，观察是否有显色出现，如有，则说明底物已变质。

3.6比色

3.6.1一定要注意酶标仪的波长是否已调至合适或所用滤光片是否正确。

3.6.2单波长或双波长比色的选择：单波长比色即是通常的以对显色具有最大吸收的波长如450nm或492nm进行比色测定；而双波长双色则酶标仪在敏感波长如450nm和非敏感波长如630nm下各测定一次；如在使用双波长比色时，一般不必设空白孔，仍设空白孔，就可能会造成测定孔吸光度为负数的现象。由于ELISA测定中单个空白孔的非特异吸收上有一定程度的不确定性，也就是说每次测定或同次测定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度测定值，故而在ELISA测定比色时，最好是使用双波长比色。

3.7正确结果判定解释

3.7.1阴阳性对照判定：检查阴阳性对照OD值是否达到试剂的要求，阳性对照的OD值要大于或等于一个定值，阴性对照的OD值要小于或等于一个定值，实验才成立。

3.7.2检查Cut-off值的计算是否正确。

3.7.3检查样品的S/CO比值（样品的OD值/Cut-off值的），样品S/CO比值大于1的为阳性反应、小于1的为阴阳反应，注意灰区样品10%。

3.8室内质控分析

3.8.1内部对照质控血清是指每个酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒内厂方提供的一套阴性和阳性对照。每次试验均应按试剂盒说明书中的要求设立阴、阳性对照作为内部质控。

3.8.2外部对照质控血清自2007起由江西省疾病预防控制中心HIV确认实验室提供弱阳性对照，每次实验时必须使用这一外部对照质控血清，与标本一起检测，与便监控实验的重复性和稳定性。同时可以了解各批试剂盒的批间或孔间差异，绘制质量控制图。外部对照质控血清按一周实验用量分装、分类、标记、封口、-20℃冻存于非自动除霜冰箱中。外部对照血清不可反复冻融，一旦融化后应该存放2-8℃，供一周内使用。

3.8.3质控图最常用的质控图是Levey-Jennings质控图，使用累计和技术或趋势分析技术的图形可提供系统偏移和漂移的状况[2]

3.8.3.1绘制指控图在常规条件下，对同一批血清连续测定20次或以上，获得一组S/CO值，求均数（x）和和标准差（s），超出2s或3s的数据不应删出。将均值和标准差分别在质控框架图中标出来。以S/CO值作纵坐标，以每一次试验做横坐标，绘制质控图。

3.8.3.2质控规则及使用在艾滋病筛查实验室ELISA试验中通常用的是12s和13s规则。出现一次2s范围的变化是，系统处于告警状态，应注意，是否可以继续检测要进一步观察；出现下列情况时，表示失控，应暂停检测查找原因：①出现一次3s范围的变化。②连续两次出现同一方向2s范围变化。③连续四次出现同一方向的1s范围的变化。④连续10次结果都在1s范围内，但落在均值线的同一侧。

3.8.3.3质控制图的重新制定控制图是根据稳定状态下的条件（人员、设备、原材料、检测试剂、环境，来制定的。如果上述条件变化，如操作人员更换、设备更新，采用新的试剂或其他，环境改变等等，这时，控制图也必须重新加以制定。由于控制图是科学管理检测过程的重要依据，所以经过相当时间的使用后应重新抽取数据，进行计算，加以检验。

3.8.4“即刻法”质控[2]验室用同一批号试剂盒连续常规测20次，难度较大时，可采用“即刻法”质控质控统计方法，对同一批外部质控血清连续测定3次后，即可对第3次检验结果进行质控。

3.8.5失控原因分析

3.8.5.1分析原始数据及初步估计失控原因这里“原始数据”是指未经过计算或换算的检测数据，如吸光度读数等。这些数据是最直接、最真实地反映检测情况的第一手资料。当发生失控时，对该项目同批测定的全部原始数据(包括校准品、试剂空白或质控品及患者样本等)结合近期室内质控图和平时的经验进行分析，往往有助于估计失控原因的大体方向，提示误差类型和失控原因，使查找原因的工作更有重点。

3.8.5.2对具体检测过程进行回顾分析失控后，应对该批检测的全过程进行迅速、仔细的回顾。分析有无特殊情况，如电压波动、仪器不稳、试剂瓶标签脱落、试剂放置位置不符合要求、质控品瓶盖松动、复溶过程异常等。并应检查使用的容器、量器是否正确、仪器有无变动(如波长旋钮移动了位置)、校准品或试剂有无变更生产厂家、批号或接近失效期等，同时复查计算结果。

4实验后的质量控制

4.1实验者填写报告和负责人审阅报告实验者正确填写报告，结果为阴性反应的样品发出“HIV抗体阴性”报告，结果为阳性反应的样品应填写阳性复检单，送上级实验室进一步确证。同时实验者和审阅人要签字。

4.2定期做计算机备份酶标打印结果、来样品记录、血清库记录、报告单等均要做计算机备份。

4.2实验记录和文件管理记录详细，如：实验室温度、试剂名厂称和批号、仪器使、台面、高压锅消毒、样品的结果、冰箱、水浴箱等记录。详细的记录是分析、统计、总结的基础。各原始记录包括实验室室内控制记录、原始记录表、打印数据、检测记录表、标本记录表、以及仪器设备维修和校准记录等重要记录都应该妥善党，保存时间一般为15年。完整资料将为科研和法律诉讼提供可靠的证据。

5ELISA检测中可能出现的问题及可能原因分析

5.1弱阳性质控样本检测不出温育的时间或温度不够；显色反应时间太短；所用配制缓冲液的蒸馏水有问题。

5.2测定的重复性差可能的原因相同样本两次测定结果不一致，这是典型的由测定操作引起的问题：加样本及试剂量不准；孔间不一致；加样过快，孔间发生污染；加错样本；加样本及试剂时，加在孔壁上部非包被区；不同批号试剂盒中组分混用；温育时间、洗板、显色时间与说明书不一致；孔内有污染杂物；酶标仪滤光片不正确；血清标本未完全凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出现假阳性反应等。

5.3白板（阳性对照不显色）漏加酶结合物或漏加显色剂A或B；洗板液配制中出现问题，如量筒不干净，含酶抑制物（如叠氮钠）等；终止剂当显色剂使用。

5.4全部板孔均有显色洗板不干净；显色液变质；加底物的吸嘴受酶污染；洗板液受酶等污染。

6讨论

在HIV抗体初筛检测中，应建立一个全面的质量保证体系，质量保证、质量控制、质量评价时其重要部分。在全面的质量管理体系中质量控制特别是室内质量控制是个重要的环节，如何做好室内质量控制对我们实验室工作人员是最重要的，实验室人员不但要有一定的专业知识技术水平，熟悉本实验室工作的内容，更重要的是要有强烈的责任心，严格按SOP文件和试剂说明书进行操作。实验过程中能够及时发现并能及时地正错误，使工作的失误率降到最低。在实验过程中避免人为的加样错误，做到加样准确。总之实验室工作人员必须增强质控意识，按质控要求做好室内质控，在做好室内质控的基础上积极参加省级以上的HIV抗体检测能力验证。保证实验结果的正确性和准确性。

参考文献

［1］全国艾滋病检测工作规范[S].

［2］全国艾滋病检测技术规范[S].