蛋白芯片技术检测肝癌患者血清磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的建立与应用

蛋白芯片技术检测肝癌患者血清磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的建立与应用

刘召波1吴敏1刘超1刘海东1高大明1张爱英2林栋栋1△李

1首都医科大学附属北京佑安医院普通外科中心北京100069

2北京市肝病研究所北京100069

摘要目的：研究探索应用蛋白芯片技术检测肝癌患者血清磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC-3)的可行性。方法：应用Nano-PlotterTM-压电式微量喷墨点阵制备系统制备GPC-3抗体蛋白芯片,用伯乐成像仪检测成像信号。结果：应用蛋白芯片技术检测肝癌血清46份，健康人群血清18分。其中35份肝癌血清检测到GPC-3阳性表达信号，阴性对照及健康人群血清未检测到阳性信号。结论：本研究成功地建立了检测肝癌患者血清GPC-3的蛋白芯片方法，可用于肝癌患者GPC-3的检测，是一种切实可行，经济、便捷、省时、有效的方法。

关键词:磷脂酰肌醇蛋白聚糖3；蛋白芯片；肝细胞癌

*基金项目：国家重大科技专项（2017ZX10203205-006-003）肝癌肝移植个性化基因治疗新策略研究

作者简介：刘召波（1982-），男，硕士研究生，主要研究方向：肝癌，E-mail:liuzhaobo66@163.com。

共同第一作者：吴敏（1991-）男，硕士研究生，主要研究方向：肝癌，E-mail:wm13366621237@163.com。

△通讯作者：李宁（1970-），男，博士生导师，教授，主要研究方向：肝癌。E-mail:lining@bjyah.com.cn，电话：010-83997175。

△共同通讯作者：林栋栋（19）男，博士生导师，教授，主要研究方向：肝癌。E-mail:ldd1231@sohu.com。

前言

原发性肝癌（Primaryhepaticcancer，PHC）主是指源自肝细胞的肝细胞肝癌（Hepatocellularcarcinoma，HCC），肝细胞癌占原发性肝癌的大部分，少部分为肝内胆管癌（intrahepaticcholangiocarcinoma，ICC）[1]。原发性肝癌为排名世界第五的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡第四大原因[1]。GPC-3属于磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypicans)家族,与肝癌的转移与复发等生物学行为及分期和生存期密切相关;其主要通过旁分泌和自分泌的方式激活Wnts信号途径发挥作用，促进多种肿瘤组织细胞生长[2]。因此如何快速、有效地检测出GPC-3是非常重要的课题。蛋白芯片技术较传统方法具有简单、方便、耗时少、高通量等优势。蛋白芯片技术目前已经成功应用于检测AFP，AFP-L3，GP73等肝癌肿瘤标记物[3]。因此，本研究试图探索应用蛋白芯片法检测肝癌患者血清GPC-3的可行性。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1标本选择

本研究中使用的血清标本为首都医科大学附属北京佑安医院血清资源库样本。经术后病理确诊的肝细胞癌患者术前预留血清及健康人群血清。除外其它的恶性肿瘤患者，尤其是黑色素瘤患者。

1.1.2试剂和仪器

醛基芯片（上海百傲公司），鼠源GPC-3单克隆抗体（R＆DSYSTEMS公司）；10%牛血清白蛋白(BSA)(美国sigma)；HRP发光底物（德国MerckMillipore公司）；伯乐成像仪(BIO-RADCHEMIDOCMPimagingsystem美国BIO公司)，Nano-PlotterTM-微量喷墨点阵制备系统（德国GESIM公司）。

1.2实验方法

1.2.1芯片的点样将醛基芯片贴纸做成10个待检测窗口，利用TheNano-PlotterTM-微量喷墨点阵制备系统，将浓度1mg/ml的鼠源GPC-3单克隆抗体点样在醛基芯片检测窗内，10%牛血清白蛋白点样在醛基芯片检测窗内作为阴性对照，每种试剂每个检测窗各点样3次。点样后4℃过夜，用10%山羊血清37°C封闭2h，0.05%PBST洗涤3次，室温干燥，4℃保存备用。

1.2.2芯片的检测流程

①取备用的蛋白芯片至室温5min平衡后,每个检测窗加入待检测血清15ul，37℃湿盒孵育30分钟，使血清中的GPC-3蛋白与芯片上固定的GPC-3单克隆抗体结合形成抗原-抗体复合体；然后0.05%的PBS-Tween洗涤芯片，每次60s×3次，洗脱非特异结合；

②每个检测窗加入PBS稀释的HRP标记GPC-3抗体15μl（稀释比例1:150），37℃湿盒孵育30分钟，HRP标记GPC-3抗体在芯片上形成HRP标记GPC-3抗体-GPC-3-GPC-3抗体复合体；然后利用0.05%的PBS-Tween洗涤芯片，每次60s60s×3次，洗脱非特异结合；

③加入HRP发光底物,1min后通过伯乐成像仪对HRP信号进行成像检测。检测醛基玻片上的HRP化学发光像素，像素与检测样本中待检抗原量成正向相关。

④扫描化学发光像素并计算像素值(OD值)。

1.3统计方法

以上检测试验重复2次,数据为试验结果的平均值。统计学分析采用IBMSPSS22.0软件,计量资料用均数±标准差表示,采用独立样本t检验,P＜0.05有统计学意义。

2结果

应用伯乐成像仪对玻片进行曝光，曝光时间为60s，扫描结果后获得了肝癌患者和健康人群血清样本的化学发光像素值（OD值）

图1GPC-3点样芯片检测肝癌（图A）和正常血清样本扫描图（图B），10号格内均为阳性对照。

本蛋白芯片的实验结果：如图1所示实验结果扫描图，10号阳性对照为均为阳性结果，所有阴性对照均为阴性结果，其中肝癌样本1，4，8呈现高发光信号，说明该样本GPC-3高表达，2号肝癌标本呈现现低发光信号，说明该肝癌血清样本的GPC-3低表达；健康人群血清标本检测未检测到信号，表明健康人群血清标本未见GPC-3表达。

实验结果表明该芯片成功检测到肝癌患者血清中GPC-3的表达，证实本实验采用的蛋白芯片能够有效检测肝癌患者血清中GPC-3。46份肝癌血清中35份检测到GPC-3（76.1%），阴性对照及肝硬化患者及健康人群血清未检测到GPC-3的表达，证实该蛋白芯片检测方法的假阳性为0。

两组检测结果OD值进行比较，肝癌患者组的OD值明显高于健康人群对照组，说明肝癌患者组血清中GPC3水平明显高于健康人群，采用独立样本t检验，P<0.01存在显著统计学差异。

3讨论

目前GPC-3已经成为肝癌诊断和靶向治疗的热点[4]。因此如何快速、有效地检测出GPC-3是非常重要的课题。目前文献报道的GPC-3检测方法主要为夹心酶联免疫吸附法、化学发光免疫分析法和放射免疫法等[5]，酶联免疫吸附法存在加样时间长、过程复杂等诸多局限性，化学免疫分析法存在过程复杂、耗时长、设备昂贵等不足。蛋白芯片技术是新型的高通量检测方法，已发展成为一种成熟的蛋白质检测方法，广泛应用于抗体检测、糖蛋白检测，具有高通量、微量样本和微量试剂检测等的优势，本研究团队既往利用蛋白芯片技术在肝癌肿瘤标志物检测方面进行了大量的研究，实现肝癌肿瘤标志物准确及经济检测，检测血清微量化[7]。

本研究所示蛋白芯片检测方法简单、准确、快速、敏感性强，可应用于肝癌血清标记物的检测及筛查；醛基芯片抗原-抗体结合具有高特异性，使得该检测方法准确性高；同时采用压电式技术对芯片进行点样，仅需喷点0.05nl的液体到基质上，节省试剂的用量；HRP化学发光法灵敏度高，检测样品中抗原浓度与成像仪检测的发光像素值呈正相关性，因此可定量检测样品GPC-3水平。

综上所述，本实验证实蛋白芯片技术可有效检测肝癌患者血清GPC-3，因此本研究建立的GPC-3蛋白芯片方法，可应用于肝癌患者血清GPC-3的快速检测。本方法兼有方便省时和经济实用两大优势，未来可应用于进行大规模的肝细胞癌筛查，有助于提高原发性肝癌的早期诊断率。

参考文献

[1]GBD2015MortalityandCausesofDeathCollaborators.2015MortalityandCausesofDeathCollaborators.Global,regional,andnationallifeexpectancy,all-causemortality,andcause-specificmortalityfor249causesofdeath,1980-2015:asystematicanalysisfortheGlobalBurdenofDiseaseStudy2015.Lancet.2016;388(10053):1459-1544.

[2]ChenM,LiG,YanJ,etal.Reevaluationofglypican-3asaserologicalmarkerforhepatocellularcarcinoma[J].ClinChimActa2013;423:105–11.

[3]刘超,刘召波,刘海东,等.AFP-L3蛋白芯片的建立与应用.现代生物医学进展,2018,v.18(15):187-191.

[4]WuY,LiuH,DingH,etal.GPC-3inhepatocellularcarcinoma:currentperspectives[J].HepatocellCarcinoma.2016Nov8;3:63-67.

[5]TangkijvanichP,ChanmeeT,KomtongS,etal.Diagnosticroleofserumglypican-3indifferentiatinghepatocellularcarcinomafromnon-malignantchronicliverdiseaseandotherlivercancers[J].GastroenterolHepatol.2010Jan;25(1):129-37

[6]JambariNN,WangX,AlcocerM,etal.ProteinMicroarray-BasedIgEImmunoassayforAllergyDiagnosis[J].MethodsMolBiol,2017,1592:129-137.

[7]ZhangA,XiuB,ZhangH,etal.Proteinmicroarray-mediateddetectionofantienterovirusantibodiesinserum[J].IntMedRes,2016,44(2):287-296.