乳腺疾病免疫组织化学染色的方法及意义

乳腺疾病免疫组织化学染色的方法及意义

衣琳王丽萍

衣琳王丽萍

（武警黑龙江省总队医院黑龙江哈尔滨150076）

【摘要】目的：探讨乳腺疾病的免疫组织化学染色的方法及临床意义。方法：对30例乳腺癌患者用免疫组织化学染色方法检测的方法及意义进行分析。结果：免疫细胞化学重复性、稳定性较好，有助于提高针吸细胞学的准确率，并可给临床提供有助于观察预后的良好指标。结论：免疫组织化学是已被广泛运用于肿瘤研究和诊断。免疫细胞化学则也在人们的实验摸索中逐渐被推广，其方法较易掌握，并且重复性、稳定性较好，有助于提高针吸细胞学的准确率，并可给临床提供有助于观察预后的良好指标。

【关键词】乳腺疾病；免疫组织化学染色；方法；意义

【中图分类号】R394【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2016）01-0055-02

近年来分子生物技术发展很快，常用于诊断细胞学中的技术有免疫组织化学、免疫细胞化学、PCR原位杂交技术和原位PCR。主要是肿瘤相关抗原，借以判断肿瘤的来源和分化程度，协助肿瘤的病理诊断和鉴别诊断，常用的染色方法有过氧化物酶-抗过氧化物酶法，即PAP法。现对30例乳腺癌患者免疫组织化学染色在乳腺恶性肿瘤诊断中的技术及运用分析如下。

1.资料与方法

1.1标本

选取2014年6月～2015年6月收治的乳腺癌患者30例，术中做冷冻切片的乳腺肿瘤标本送病理科检测。

1.2方法

常用的染色方法有过氧化物酶-抗过氧化物酶法，即PAP法。

1.2.1染色步骤冷冻切片或石蜡切片均可。冷冻切片可用丙酮固定10min左右，石蜡切片需经脱蜡，各级乙醇至水。根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复[1]。每张切片加1滴或50?L过氧化酶阻断溶液，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温孵育10min；或用0.3%的H202和80%甲醇液处理切片，室温30min。磷酸盐缓冲生理盐水(0.01mol/L，pH7.2～7.4)冲洗3×5min。吸去PBS液，每张切片加1滴或50?L非免疫性动物血清，室温孵育10min，减少非特异生背景，不必冲洗，只需吸去多余的液体；或用5%正常羊血清处理切片，室温30min。PBS(0.01mol/L，pH7.2～7.4)冲洗3×5min。每张切片加50μl非免疫性动物血清，室温孵育10min，减少非特异性背景，不必冲洗，只需吸去多余的液体；或用5%正常羊血清处理切片，室温30min。吸去血清，每张切片加1滴或501?L的第一抗体，室温孵育60min或37℃孵育45min或4℃孵育13～24h。PBS冲洗3×5min。吸去PBS液，每张切片加l滴或50μL生物素标记的第二抗体(1：200左右)，室温孵育30min或37℃，孵育10min。PBS冲洗3×5min。吸去PBS液，每张切片加50μL链霉菌抗生物素蛋白，过氧化物S-P溶液，室温孵育30min或37℃孵育10min。PBS冲洗3×5min。吸去PBS液，每张切片加2滴或100μL新鲜配置的酶底物显色液DAB通常为0.05%DAB0.03%H2O2液)或AEC)进行显色3-10min。蒸馏水或自来水冲洗。苏木素复染。根据不同显色系统选择相应的封片剂(中性树胶或水性封片剂)进行封片，观察。

1.2.2正确的判断结果在做免疫细胞化学前，原涂片需进行常规染色，得出初步诊断意见，选定免疫细胞化学标记物及靶细胞，了解常规细胞涂片的细胞分布及形态特点。染色过程中，虽经阻断反应，但组织细胞中的内源性过氧化物酶，碱性磷酸酶或生物素等，可产生非特异性显色，镜下需能识别，防止误认为阳性细胞。阳性细胞的分布：涂片中阳性细胞可群集，也可散在，着色有深有浅，需注意的是有些正常的组织细胞易着色夹在肿瘤细胞之中，需鉴别。阳性细胞的标准：不同的标记物阳性颗粒分布的部位也不同，如Kerain、EMA、CEA分布于胞浆，PCNA、P21、P53、ER、PR等分布于细胞核，而LCA、CD20。则分布干细胞膜。

2.结果

ER阳性16例(+7例，++6例，+++3例)，PR阳性23例(+13例，++8例，+++2例)，Her-2阳性17例(+10例，++4例，+++3例)，P53阳性13例(+7例，++4例，+++2例)。免疫细胞化学重复性、稳定性较好，有助于提高针吸细胞学的准确率，并可给临床提供有助于观察预后的良好指标。

3.免疫组织化学染色意义

3.1激素受体

（1）雌激素受体(ER)阳性乳腺癌称为雌激素依赖性乳腺癌。反之，瘤细胞只保留甚少甚或完全失去受体系统而不受激素调控的肿瘤，称为非激素依赖性肿瘤。（2）ER阳性率约为55％～65％。ER阳性的判断标准如下：癌细胞核内有棕黄色颗粒者为ER阳性细胞，这些细胞成团或分散于成片的癌细胞中。癌细胞核内颗粒呈淡黄色，阳性细胞占10%～25%为(+)；棕色颗粒较深，阳性细胞占25%～50%为(++)；棕色颗粒量多，深棕色，阳性细胞数＞50％为(+++)[2]；阳性细胞数<10%为阴性。（3）乳腺癌细胞尚有孕酮受体(PR)，检测ER同时检测PR，将更准确预测乳腺癌激素依赖性和提高内分泌治疗的有效率。（4）PR的阳性率在绝经前、后分别为58%和53%。PR阳性判断标准与ER相同。（5）大多数PR(+)的乳腺癌，ER也是(+)，小于10%的乳腺癌是ER(-)、PR(+)。单独ER(+)的病人对内分泌治疗有反应的占55％，ER(+)、PR(+)的病人对内分泌治疗有反应的可达75%～80%。一般认为，ER和PR均为阳性病人对内分泌疗法效果最佳；相反的，两者都为阴性的效果差。ER阳性病例的预后比阴性的为好，缓解率高而复发率低。因此，ER、PR检测是选择内分泌治疗和提供判断病人预后的一个重要指标。

3.2Her-2与乳腺

癌原癌基因Her-2也称C-erbB-2或Her-2/neu，其过表达与乳腺癌患者的预后不良相关，具有独立的预后价值。Her-2免疫组化染色呈胞膜阳性(胞质染色也可存在阳性)。染色结果判断标准如下：未见或<10％的癌细胞膜染色为(-)；>10%癌细胞膜染色，但着色不完全(即不连续)为(+)；>10%癌细胞膜染色完全，但呈弱或中度染色为(++)；若完全染色且为强染色即为(+++)。现普遍认为Her-2过表达患者对环磷酰胺、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶(CMF)合并化疗产生抵抗性。乳腺癌细胞PR、ER阳性患者内分泌治疗有较好的疗效，但若Her-2同时阳性则会对内分泌治疗的效果产生负面影响。

3.3上皮标记

（1）癌胚抗原(CEA)：免疫组化方法测定乳腺癌CEA的阳性率为56.9%。CEA阳性是一种高复发率与较差预后的指标。（2）上皮膜抗原(EMA)：EMA虽非乳腺所特有，但在诊断上可用于乳腺癌与非上皮性肿瘤的鉴别。（3）角蛋白：在乳腺导管癌和小叶癌角蛋白呈阳性，而在纤维腺瘤和叶状囊肉瘤内梭形细胞则呈阴性。

3.4非上皮细胞标记

用于诊断乳腺非上皮性肿瘤，包括：（1）白细胞共同抗原(LCA)的单克隆抗体用于乳腺淋巴瘤的诊断。（2）vimentin抗血清用于肉瘤的诊断[3]。（3）第Ⅷ因子用于血管肉瘤的诊断。

3.5收缩蛋白

肌上皮细胞含有高浓度的收缩蛋白，故可用肌动蛋白或肌球蛋白的抗血清去辨认。在鉴别富有肌上皮的硬化性腺病与通常缺少肌上皮的小管癌上具有诊断价值。

3.6基膜成分

基膜蛋白有层粘连蛋白和Ⅳ型胶原等，层粘连蛋白抗体和Ⅳ型胶原抗体的免疫组化染色在正常乳腺、纤维腺瘤、硬化性腺病和上皮增殖的上皮周围可见完整的基膜，而在管内癌则在轮廓欠清的着色区和微小浸润灶出现着色断裂或缺失。

3.7内皮细胞标记

内皮细胞可被第Ⅷ因子抗血清及CD34、CD31抗血清染色，故对此血管侵入的发现具有价值。

【参考文献】

[1]中华医学会.临床技术操作规范病理学分册[M].北京：人民军医出版社,2004：10-12.

[2]刘华庆，黄琼，胡莉.乳腺癌冻对蜡块与冻剩蜡块免疫组织化学染色效果比较[J].贵州医药,2011,35(7):602-604.

[3]张艳梅，李莹杰，杜金荣.免疫组化在乳腺良、恶性疾病鉴别诊断中的意义[J].哈尔滨医科大学学报,2008,42(05):492-493.