150例MRSA菌株毒力基因和耐药基因的检测分析*

150例MRSA菌株毒力基因和耐药基因的检测分析*

伍仙何树光（通讯作者）

湖南中医药高等专科学校附属第一医院检验科（湖南省直中医医院）湖南株洲41200

摘要：目的：探讨分析我院耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的毒力基因和耐药基因基本情况。方法：选择2016年12月-2018年2月期间我院住院患者中分离到的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌150株为研究对象，使用PCR法对MRSA菌株进行毒力基因和耐药基因分析。结果：150株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对tst、pνl、psm—mec、sasX、qacA/B、tetM、ermA/B/C、aph（3’）-Ⅲ、aac（6’）/aph（2’’）以及mecA的阳性率分别为0、96.67%、93.33%、74.67%、38.67%、90.0%、96.67%、77.33%、96.67%以及100%。结论：MRSA同时携带毒力基因和耐药基因，与人体感染性疾病的转归、病程以及种类等有关。

关键词：毒力基因；耐药基因；金黄色葡萄球菌

Objective：Tostudythevirulencegenesanddrugresistancegenesofmethicillin-resistantStaphylococcusaureus（MRSA）.Methods：150strainsofmethicillin-resistantStaphylococcusaureusisolatedfromourhospitalfromDecember2016toFebruary2018wereselectedasstudyobjects.ThevirulencegenesanddrugresistancegeneswereanalyzedbyPCR.Results：Onehundredandfiftystrainsofmethicillin-resistantStaphylococcusaureusweretreatedwithTSTPνpsm-mecssm-mecsaspsm-mecspsm-mecspsm-mecs/BtetMecermAr/B/mapmAr/B/mapmAr（Ⅲ）ThepositiveratesofmecAandmecAwere0，96.67，93.33，74.67，38.67，90.0and96.677.33，respectively，and96.67percentand100percent，respectively.Conclusion：BothvirulencegeneanddrugresistancegenewerecarriedbyWMRSA，whichwererelatedtotheoutcome，courseandtypeofinfectiousdiseases.

[Keywords]Virulencegene，drugresistancegene，staphylococcusaureus

金黄色葡萄球菌是临床上比较常见的毒性较强的细菌。虽然青霉素问世后，金黄色葡萄球菌引起的感染性疾病受到很大的抑制，青霉素一度成为金黄色葡糖球菌的“天然克星”。但随着青霉素的广泛使用，临床抗生素的滥用，出现了金黄色葡萄球菌产生青霉素酶，能水解β-内酰胺环，表现为对青霉素的耐药。自Jevons首次发现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）以来，MRSA已成为院内和社区感染中常见的耐药菌。近年来，临床对耐药菌的研究不断深入，随着分子诊断不断应用到临床微生物诊断中，有学者研究发现，院内感染患者的症状表现不仅与基础性疾病、感染部位等因素有关，在一定程度上还与携带类型不同感染菌株的毒力因子有关[1]。因此，本文对MRSA的耐药基因和毒力基因携带情况进行了检测分析，初步了解我院目前MRSA菌株耐药基因及毒力基因基本情况。对于我院MRSA耐药菌的控制监测有一定的临床价值。

1、资料和方法

1.1一般资料

选择我院2016年12月-2018年2月期间从住院患者中分离到的150株非重复耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）标本为研究对象，主要分布于呼吸内科、外科ICU、内科ICU、肿瘤科、老年病科，年龄在27-82岁之间，男：女=89：61，其中100株为痰液标本、20株为脓液标本、20株为尿液标本、10株为血液标本。

1.2方法

1.2.1药敏试验

运用梅里埃VITEK—2细菌鉴定仪鉴定菌种，运用纸片扩散法（K-B法）法进行耐甲氧西林金黄色葡萄球菌临床分离株的药敏试验，采用2015年CLSI标准判定结果，统计菌株的敏感、中介、耐药情况。

1.2.2制备细菌DNA

细菌DNA的提取挑取经血平板过夜培养的金黄色葡萄球菌单个菌落，加至离心管中，并加入250μL双蒸水混匀，再加入蛋白酶K和溶葡萄球菌素，37℃温育一小时，再煮沸15min，低温高速离心（15000r/min）10分钟，保留上清液于无菌离心管中，-20℃冷冻保存备用。蛋白酶K裂解法，选择上海市克隆遗传技术研究所的裂解液A和B。

1.2.3检测基因

运用PCR法检测4种毒力基因和6种耐药基因，运用上海市克隆遗传技术研究所提供的阳性DNA对照和PCR扩增试剂盒，严格按照试剂说明要求进行操作。

1.2.4DNA测序

由上海生物技术有限公司进行DNA测序，运用Chromas软件对测序结果进行BLASTSearch比较分析。

2、结果

2.1药敏试验结果

150株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的药敏实验结果见表1。

表1药敏试验结果

2.2毒力基因与耐药基因检测结果

150株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对tst、pνl、psm—mec、sasX、qacA/B、tetM、ermA/B/C、aph（3’）-Ⅲ、aac（6’）/aph（2’’）以及mecA的阳性率分别为0、96.67%、93.33%、74.67%、38.67%、90.0%、96.67%、77.33%、96.67%以及100%，见表2。

表2MRSA耐药基因与毒力基因的阳性率

3.讨论

一般来讲，金黄色葡萄球菌获得葡萄球菌盒状染色体（SCCmec）作为MRSA形成的一个重要因素，mecA基因存在于类型不同的SCCmec元件中，其中mecA基因与转肽酶活性青霉素结合蛋白2’（PBP2’）的表达相同，并且PBP2’与β内酰胺类药物的结合能力不高，但是PBP2’在功能方面与金黄色葡萄球菌自体的PDP2相似，所以呈现出对所有β-内酰胺类耐药[2-3]。本次研究发现，MRSA对喹诺酮类、四环素、大环内酯类、氨基糖苷类以及β-内酰胺类具有较高的耐药率，并且6种耐药基因的检出率较高。同时，金黄色葡萄球菌tst基因能够表达TSST-1，其中TSST-1作为一种超抗原，能够将T淋巴细胞激活，释放大量炎症介质，但是在本次研究中，MRSAtst基因均为阴性[4-5]。此外，金黄色葡萄球菌pνl基因能够表达Panton-Valen-tineLeucocidin（PVL）杀白细素[6-7]，有研究发现[8-9]，金黄色葡萄球菌Pνl基因的高表达能够诱发单核细胞坏死，并且释放大量的炎性因子，进一步损伤宿主细胞，其中肺部、软组织以及皮肤等部位炎症的发生与PVL有关[10]。

综上所述，MRSA同时携带毒力基因和耐药基因，并且人体感染性疾病的种类、病程以及转归与MRSA有关，进一步深入研究MRSA毒力基因和耐药基因的分布情况，有利于临床更加合理使用抗生素，有助于临床耐药菌的监测与控制，有助于进一步提高临床诊断与治疗水平。

目前耐甲氧西林金黄色葡萄球菌已经成为医院感染的重要菌种之一，由于MRSA多重耐药，造成了临床医师经常无药可用，病人无药可医的窘迫局面。通过分子诊断手段对耐药菌株的耐药机制分析研究，有利于我们更加全面了解耐药菌的形成，分布等情况，使我们微生物检验更好的服务临床。

参考文献：

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[10]Jahan，M.，Holley，R.A..Incidenceofvirulencefactorsinenterococcifromrawandfermentedmeatandbiofilmformingcapacityat25degreesCand37degreesC.[J].InternationalJournalofFoodMicrobiology，2014，170：65-69.

*【基金项目】湖南省自然科学基金项目（基金号：2018JJ6116），湖南省卫生计生委科研项目（基金号：C20180716）

**【通讯作者】何树光（1970.12），男，主任检验师，硕士研究生导师，主要从事病原微生物致病机制研究。

【作者简介】伍仙（1984.05），男，湖南石门人，硕士研究生，主管检验师，主要从事生化免疫，病原体感染研究工作。