出血性大肠杆菌检测进展

出血性大肠杆菌检测进展

孙文龙郭宏

天津市红桥区疾病预防控制中心

摘要：肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157∶H7为新近报道的食源性强致病菌，对病原菌快速、简便、准确、灵敏的检测方法是预防控制的关键，本文对国内外常用的鉴别培养、生化反应、免疫学等检测方法进行了系统的综述.

关键词：出血性大肠杆菌；检测

肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157：H7感染性腹泻是近年来新发现的危害严重的肠道传染病[1]。该病可引起腹泻、出血性肠炎，继发溶血性尿毒综合症（HUS）、血栓性血小板减少性紫癜（TTP）等，HUS和TTP的病情凶险，病死率高。自1982年美国首次发现该病以来，在世界上许多国家相继发生了暴发和流行，已成为全球性的公共卫生问题之一。近几年，我国已陆续有十多个省份在食品、家禽、家畜、昆虫、腹泻病患者中检出该致病菌，因而存在着疫情暴发、流行的潜在威胁。

一．鉴别培养

1.分离培养法

将无菌采集的标本，在血琼脂或麦康凯平板上划线分离培养，然后挑取血平板上呈溶血或麦康凯平板上的红色菌落进行涂片，革兰氏染色镜检，镜检后挑取培养基上的典型单个菌落，分别接种在三糖铁（TSI）培养基和普通琼脂斜面培基上做纯培养和初步生化鉴定，对TSI琼脂反应模式符合大肠杆菌特点的菌落进行肠杆菌血清型鉴定、毒力因子鉴定及动物实验[2]。

2.生化反应：

2.1山梨醇发酵利用O157∶H7大肠杆菌不发酵山梨醇，而绝大多数其他肠道菌发酵山梨醇这个特点，将麦康凯琼脂中的乳糖换成山梨醇〔1%〕，挑选出不发酵山梨醇的菌株后，再作血清学鉴定[4]，这种方法简便、易行、敏感，在临床检测中可大范围应用。

2．2棉子糖发酵[6]几乎所有的O157∶H7大肠杆菌都发酵棉子糖，而其它大肠杆菌中只有20%左右菌株发酵棉子糖。

2．3卫茅醇发酵[7]几乎所有的O157∶H7大肠杆菌都发酵卫茅醇，而大约只有50%左右的其它大肠杆菌发酵卫茅醇。

2．4鸟氨酸和赖氨酸试验[8]O157∶H7大肠杆菌能够利用鸟氨酸和赖氨酸，只有一部分其它大肠杆菌不能利用鸟氨酸和赖氨酸。如果细菌的生化反应和O157：H7抗血清的玻片凝集试验都符合标准，就可以作出鉴定。如果条件允许的话，还应该使用DNA探针技术或PCR方法[9]。

二．免疫检测

免疫血清学检测技术是利用抗原和抗体之间的特异性反应，通过检测标在反应物上的示踪物，对抗原或抗体进行定性或定量测定的快速检测技术。根标记物质的不同，目前用于检测大肠杆菌的免疫检测方法主要有以下几种。

2.1凝集试验

主要有试管凝集、玻片凝集、乳胶凝集三种，观察可疑菌与抗血清是否特性凝集。主要看一下乳胶凝集实验，以抗血清包被载体乳胶粒[13]，制成特异的乳胶试剂。试验时，把菌落涂于玻片上，滴加乳胶试剂呈现明显凝集者为阳性。乳胶凝集比血清凝集有更高的敏感性和特异性[14]。凝集试验通常与分离培养结合，具有快速、简便、特异性高的特点。

2.2酶联免疫法

酶联免疫吸附分析法（ELISA）[17]是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相合起来的一种敏感性很高的检测技术。经直接检测培养物，未发现与沙门氏菌、结肠炎耶尔森氏菌、志贺氏菌、粘质沙氏菌和肺炎克雷伯氏菌等发生交叉反应。可通过结合免疫捕获技术提高特异性用于临床标本和食品样品的快速检测[18]。

2.3荧光免疫测定技术

荧光免疫测定（FIA）[19]是以荧光素作为标记物，将免疫反应的特异性与荧光素的灵敏性结合，通过荧光分光光度计测量荧光强度推算待测物质的浓度。因其具有快速准确的特点，荧光免疫测定技术得到了快速发展。

2.4免疫磁珠分离法

免疫磁珠技术（IMS）[21]是用抗体包被磁珠，捕获待检菌后，在磁场作用下分离磁珠，浓缩、纯化待检菌液，大大提高了灵敏度。用IMS、PCR及直接培养三种方法检测病人粪便，IMS最灵敏。2．5胶体金免疫技术[23]

分为斑点免疫层析法（DICA）和斑点金免疫渗滤法（DIGFA）两种。

DICA利用的是免疫色层技术在检测卡上．将胶体金标记的兔抗O157抗体和兔抗羊IgG抗体分别固定在膜上下．作为测试带和质控带。样品增菌液滴至加样孔膜上并展开。DIGFA是预先在硝酸纤维素膜的中央滴加纯化的抗O157：H7抗体，待吸附干燥后，依次滴人待检菌液、胶体金标记O157：H7抗体及洗涤液，膜中央呈红色斑点者为阳性。

三．聚合酶链反应法（PCR）[24]

PCR是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，具有特异、敏高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，能在一个试管内将目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，可用肉眼观察和判断。可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA用于研究和检测鉴定[25]。PCR是最常用的检测大肠杆菌O157：H7致病基因的方法。

四.未来发展

基因芯片技术是近年来分子生物学及医学诊断技术的重要进展[30]。它具有高通量、微型化和自动化等特点，现已在O157：H7的诊断中得到了应用。该方法与普通凝胶电泳法相比，灵敏度增加了30倍。可以检测小于1个细胞的基因组DNA的量的PCR扩增产物[31]。

参考文献：

[1]李永红，中国部分地区人群和动物中肠出血性大肠埃希菌O157∶H7分布特征[J].疾病监测2008（7），256-264.

[2]梁国栋.最新分子生物学实验技术[M]，北京科学出版社，2007（2），368-373.

[3]李升团，韩光红，大肠杆菌O157：H7感染的病原学与流行病学[J].解放军预防医学杂志，1997（05）89-99.

[4]庄菱.大肠杆菌0157：H7抗药物敏感性研究[J].疾病监测，2007，16（4），125-127.

作者简介：孙文龙，男，1974.12，河北省，微生物检验（含病毒），天津市红桥区疾病预防控制中心检验科，300122，天津市红桥区咸阳路21号红桥区疾病预防控制中心