改良RP-HPLC法测定牡丹皮中芍药苷和丹皮酚的含量

改良 RP-HPLC法测定牡丹皮中芍药苷和丹皮酚的含量

邓德全

秀山土家族苗族自治县中和街道社区卫生服务中心，重庆， 409900

【摘要】目的：利用改良RP-HPLC（反向高效液相色谱法）对牡丹皮中的芍药苷与丹皮酚的含量进行测定。方法：采用色谱柱SunFire ODS C₁₈（4.5x250mm，5μm），然后以甲醇-水梯度洗脱，控制流速1.0ml/min，在最大的波长下检测，220mm为芍药苷，264mm为丹皮酚。结果：0.216-2.132μg范围为芍药苷，0.613-6.320μg范围为丹皮酚且线性关系良好（r分别为0.9994,0.9997），芍药苷平均回收率为99.65%，丹皮酥平均回收率为98.96%。结论：采用改良RP-HPLC方法检测，可有效控制牡丹皮质量，且该方法简单、重复性较好，准确率高，可为牡丹皮中的芍药苷与丹皮酚含量测定提高可靠参考。

关键词：牡丹皮；芍药苷；丹皮酚；改良RP-HPLC；含量检测

前言：

牡丹皮作为临床常用中医药材，可有效清热凉血、退虚热，同时还可发挥活血化瘀的作用，对经闭痛经、跌扑伤痛、温毒发斑等临床症状有显著治疗效果，为毛茛科植物牡丹干燥根皮，广泛产于安徽、河南、山东等地^[1]。而芍药苷、丹皮酚是牡丹皮中的2种完善活性成分，芍药苷可有效发挥肿瘤抑制、调节免疫的功效，对脑神经细胞、心肌有良好的保护作用，同时还可提高造血机能、抗局灶性脑缺血；而丹皮酚可抗动脉硬化、心率失常，有效保护缺血组织，提高免疫力，发挥抗癌抑菌的作用^[1]。而在牡丹皮及其复方制剂的质量标准中，常采用丹皮酚作为定量控制，但芍药苷亦是牡丹皮中活性成分，故采取改良RP-HPLC，有效测定牡丹皮中芍药苷和丹皮酚含量，为临床标准质量提供可靠依据。

1.仪器与试药

1.1仪器

HPLC（高效液相色谱）仪1100型，含有VWD（紫外线检查器）、ChemStation色谱工作站；北京赛多利斯仪器系统有限公司提供的BP211S型电子天平；美国Millipore公司提供的Simplicity-185型超纯水机；昆山市超声仪器有限公司提供的KQ500B型超声波清洗器。

1.2试剂

批号为142736-2019035，含量为95.5%的芍药苷与批号为0726-202001的丹皮酚（提供含量测定用）对照品均来自中国食品药品检定研究院提供；甲醇、乙腈由德国Merck.公司提供，为色谱纯；水是超纯水。

1.3药材

牡丹皮为市售品药材，均经中药研究院研究员鉴定，均为毛茛科芍药属植物牡丹的干燥根皮。

2.方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱为SunFire ODS C₁₈（4.6x250mm，5μm）。柱温为40℃。流动相为A（甲醇）-B（水），梯度洗脱为0-10min，34%→34%A；大于10-12min，34%-50%A；小于12-32min，50%-50%A。流速为1.0ml/min，芍药苷检测波长为220mm，丹皮酚检测波长为264mm。柱温为30℃。进样量为10μl。在该统计学，芍药苷与丹皮酚的色谱峰分离良好。

2.2溶液配置

对照品溶液：将芍药苷、丹皮酚对照品精密称取，然后向里面加入甲醇，制备成1ml含有0.107mg芍药苷与0.298mg丹皮酚分混合液。

供试品溶液：取0.5g本品粗粉精密称定，放入带有木塞的三角瓶中，加入50ml的甲醇，重量称定后，经30min的超声处理，取出、放冷，再次重量称定，以甲醇补充缺失的重量，行摇匀、过滤，滤液再次过滤（0.45μm微孔滤膜），得溶液。

2.3线性关系考察

精吸对照混合液1、4、8、15、20μl，以液相色谱仪测定，尽量芍药苷与丹皮酚的峰面积，横坐标为进样量（X，μg），纵坐标为峰面积（Y），回归方程为：Y=1.697×10⁶X-7.869×10⁴，r=0.9994（芍药苷）；Y=3.468×10⁶X+3.125×10⁵，r=0.9997（丹皮酚），可得出0.216-2.132μg为芍药苷，0.613-6.320μg为丹皮酚，线性关系良好。

2.4精密度实验

选用同一种供试品溶液，吸取10μL，注入HPLC，重复6次，测定峰面积并计算RSD（相对标准差），芍药苷与丹皮酚平均峰面积分别为1236540（RSD=1.54%）、9132422（RSD=1.41%），结果可得出，该方法精密度良好。

2.5稳定性实验

选用同一种供试品溶液，分别以APLC测定1、3、5、7、9h芍药苷与丹皮酚的平均峰面积，分别为1623446（1.26%）、9453886（1.76%），可见稳定性良好

2.6重复实验

选用相同的牡丹皮药材，制备6份供试品，测定芍药苷、丹皮酚平均含量，分别为9.67mg/g（2.13%），25.86mg/g（1.36%），可见重复性良好。

2.7加样回收率实验

取牡丹皮样品（9.67mg/g芍药苷，26.02mg/g丹皮酚），取0.25g精密称定后，放置与三角瓶中，加2.4mg芍药苷、6.6mg丹皮酚对照品，按要求配置4份加样供试品溶液，吸取10μl，注入HPLC，测定，计算加样回收率，见表1。

表1芍药苷与丹皮酚加样回收率实验结果

在本文实验中，甲醇、水、溶媒用量、超声时间等因素进行了比较与选择，确定供试品溶液的配置为：取0.5g牡丹皮粗粉+50ml甲醇，在经超声提取30min。通过芍药苷、丹皮酚的色谱峰值扫描，结果芍药苷在220mm，丹皮酚在274mm，与文献结果波长基本一致,故通过对各个时间段点的芍药苷、丹皮酚波长进行测定，可采用ChemStation色谱工作站的定时波长功能，有效转换检测波长，从而可在同一色谱条件下，对牡丹皮中的芍药苷、丹皮酚进行同时检测，显著提高检查的灵敏度与准确性，且具有普遍适用性。同时改良RP-HPLC的使用，将流动相中的磷酸去除，有效减轻对色谱柱的腐蚀程度，同时在线性范围内的浓度更低，益于样品量少与含量低的牡丹皮含量测定。

综上所述，采用改良RP-HPLC检测牡丹皮中的芍药苷与丹皮酚含量，其方法简单、快捷，且更具有科学性，可为牡丹皮质量评价提供更全面的依据，可广泛应用。

参考文献：

[1]窦红允, 黄东杰, 王孟阳. HPLC法同时测定跌打丸中芍药苷和丹皮酚的含量[J]. 中国药房, 2016, 27(27):3870-3872.

[2]江国荣, 刘少文, 陈卫民, 不同炮制方法对牡丹皮中有效成分含量的影响[J]. 临床合理用药杂志, 2017, 010(028):15-16.