改良RP-HPLC法测定牡丹皮中芍药苷和丹皮酚的含量

(整期优先)网络出版时间:2020-11-03
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改良 RP-HPLC法测定牡丹皮中芍药苷和丹皮酚的含量

邓德全

秀山土家族苗族自治县中和街道社区卫生服务中心,重庆, 409900


【摘要】目的:利用改良RP-HPLC(反向高效液相色谱法)对牡丹皮中的芍药苷与丹皮酚的含量进行测定。方法:采用色谱柱SunFire ODS C18(4.5x250mm,5μm),然后以甲醇-水梯度洗脱,控制流速1.0ml/min,在最大的波长下检测,220mm为芍药苷,264mm为丹皮酚。结果:0.216-2.132μg范围为芍药苷,0.613-6.320μg范围为丹皮酚且线性关系良好(r分别为0.9994,0.9997),芍药苷平均回收率为99.65%,丹皮酥平均回收率为98.96%。结论:采用改良RP-HPLC方法检测,可有效控制牡丹皮质量,且该方法简单、重复性较好,准确率高,可为牡丹皮中的芍药苷与丹皮酚含量测定提高可靠参考。

关键词:牡丹皮;芍药苷;丹皮酚;改良RP-HPLC;含量检测

前言:

牡丹皮作为临床常用中医药材,可有效清热凉血、退虚热,同时还可发挥活血化瘀的作用,对经闭痛经、跌扑伤痛、温毒发斑等临床症状有显著治疗效果,为毛茛科植物牡丹干燥根皮,广泛产于安徽、河南、山东等地[1]。而芍药苷、丹皮酚是牡丹皮中的2种完善活性成分,芍药苷可有效发挥肿瘤抑制、调节免疫的功效,对脑神经细胞、心肌有良好的保护作用,同时还可提高造血机能、抗局灶性脑缺血;而丹皮酚可抗动脉硬化、心率失常,有效保护缺血组织,提高免疫力,发挥抗癌抑菌的作用[1]。而在牡丹皮及其复方制剂的质量标准中,常采用丹皮酚作为定量控制,但芍药苷亦是牡丹皮中活性成分,故采取改良RP-HPLC,有效测定牡丹皮中芍药苷和丹皮酚含量,为临床标准质量提供可靠依据。

1.仪器与试药

1.1仪器

HPLC(高效液相色谱)仪1100型,含有VWD(紫外线检查器)、ChemStation色谱工作站;北京赛多利斯仪器系统有限公司提供的BP211S型电子天平;美国Millipore公司提供的Simplicity-185型超纯水机;昆山市超声仪器有限公司提供的KQ500B型超声波清洗器。

1.2试剂

批号为142736-2019035,含量为95.5%的芍药苷与批号为0726-202001的丹皮酚(提供含量测定用)对照品均来自中国食品药品检定研究院提供;甲醇、乙腈由德国Merck.公司提供,为色谱纯;水是超纯水。

1.3药材

牡丹皮为市售品药材,均经中药研究院研究员鉴定,均为毛茛科芍药属植物牡丹的干燥根皮。

2.方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱为SunFire ODS C18(4.6x250mm,5μm)。柱温为40℃。流动相为A(甲醇)-B(水),梯度洗脱为0-10min,34%→34%A;大于10-12min,34%-50%A;小于12-32min,50%-50%A。流速为1.0ml/min,芍药苷检测波长为220mm,丹皮酚检测波长为264mm。柱温为30℃。进样量为10μl。在该统计学,芍药苷与丹皮酚的色谱峰分离良好。

2.2溶液配置

对照品溶液:将芍药苷、丹皮酚对照品精密称取,然后向里面加入甲醇,制备成1ml含有0.107mg芍药苷与0.298mg丹皮酚分混合液。

供试品溶液:取0.5g本品粗粉精密称定,放入带有木塞的三角瓶中,加入50ml的甲醇,重量称定后,经30min的超声处理,取出、放冷,再次重量称定,以甲醇补充缺失的重量,行摇匀、过滤,滤液再次过滤(0.45μm微孔滤膜),得溶液。

2.3线性关系考察

精吸对照混合液1、4、8、15、20μl,以液相色谱仪测定,尽量芍药苷与丹皮酚的峰面积,横坐标为进样量(X,μg),纵坐标为峰面积(Y),回归方程为:Y=1.697×106X-7.869×104,r=0.9994(芍药苷);Y=3.468×106X+3.125×105,r=0.9997(丹皮酚),可得出0.216-2.132μg为芍药苷,0.613-6.320μg为丹皮酚,线性关系良好。

2.4精密度实验

选用同一种供试品溶液,吸取10μL,注入HPLC,重复6次,测定峰面积并计算RSD(相对标准差),芍药苷与丹皮酚平均峰面积分别为1236540(RSD=1.54%)、9132422(RSD=1.41%),结果可得出,该方法精密度良好。

2.5稳定性实验

选用同一种供试品溶液,分别以APLC测定1、3、5、7、9h芍药苷与丹皮酚的平均峰面积,分别为1623446(1.26%)、9453886(1.76%),可见稳定性良好

2.6重复实验

选用相同的牡丹皮药材,制备6份供试品,测定芍药苷、丹皮酚平均含量,分别为9.67mg/g(2.13%),25.86mg/g(1.36%),可见重复性良好。

2.7加样回收率实验

取牡丹皮样品(9.67mg/g芍药苷,26.02mg/g丹皮酚),取0.25g精密称定后,放置与三角瓶中,加2.4mg芍药苷、6.6mg丹皮酚对照品,按要求配置4份加样供试品溶液,吸取10μl,注入HPLC,测定,计算加样回收率,见表1。

表1芍药苷与丹皮酚加样回收率实验结果

分组

取样量/g

样品含量/mg

加入量/mg

测得量/mg

回收率/%

平均回收率/%

RSD/%

芍药苷

0.2524

2.46

2.61

4.99

95.43

97.82

1.86

0.2536

2.48

2.43

4.92

98.65

0.2542

2.49

2.55

4.97

97.56

0.2516

2.50

2.43

5.00

99.65

丹皮酚

0.2531

6.55

6.72

13.26

99.65

99.80

1.56

0.2512

6.60

6.77

12.42

101.65

0.2541

6.53

6.54

13.22

102.43

0.2534

6.57

6.56

13.52

95.46

3.讨论

在本文实验中,甲醇、水、溶媒用量、超声时间等因素进行了比较与选择,确定供试品溶液的配置为:取0.5g牡丹皮粗粉+50ml甲醇,在经超声提取30min。通过芍药苷、丹皮酚的色谱峰值扫描,结果芍药苷在220mm,丹皮酚在274mm,与文献结果波长基本一致,故通过对各个时间段点的芍药苷、丹皮酚波长进行测定,可采用ChemStation色谱工作站的定时波长功能,有效转换检测波长,从而可在同一色谱条件下,对牡丹皮中的芍药苷、丹皮酚进行同时检测,显著提高检查的灵敏度与准确性,且具有普遍适用性。同时改良RP-HPLC的使用,将流动相中的磷酸去除,有效减轻对色谱柱的腐蚀程度,同时在线性范围内的浓度更低,益于样品量少与含量低的牡丹皮含量测定。

综上所述,采用改良RP-HPLC检测牡丹皮中的芍药苷与丹皮酚含量,其方法简单、快捷,且更具有科学性,可为牡丹皮质量评价提供更全面的依据,可广泛应用。

参考文献:

[1]窦红允, 黄东杰, 王孟阳. HPLC法同时测定跌打丸中芍药苷和丹皮酚的含量[J]. 中国药房, 2016, 27(27):3870-3872.

[2]江国荣, 刘少文, 陈卫民, 不同炮制方法对牡丹皮中有效成分含量的影响[J]. 临床合理用药杂志, 2017, 010(028):15-16.