西尼罗病毒核酸检测法概述

西尼罗病毒核酸检测法概述

尹羿 1 任彤 1 王继文 2 周扬 3

通讯作者 :汪琳 1

1. 北京海关技术中心，北京　100032

2. 2. 北京海关动物隔离场，北京　100026

3. 3. 北京海关后勤管理中心，北京　100026

摘要 西尼罗病毒(West Nile virus)是在1937年从非洲乌干达西尼罗地区一名发热女患者的血液标本中首次被提取出来的，并因此而得名。1957年以色列爆发因西尼罗病毒导致的脑膜炎后，人们才重新重视了该病毒的危害性。虽该病毒在我国尚未发现感染病例，但随着我国与其他国家的贸易合作、人员往来日益频繁，该病传入中国的概率也有所增加，所以需要人们提高警惕意识。因该病目前没有有效的治疗措施，所以快速、准确的诊断方法是切断传播途径可以说是本病防控的重中之重。

关键词 西尼罗 核酸检测

Dauphin等人在2007年发表了对WNV诊断进展的综述^[1]。从此以后西尼罗病毒的关注焦点更多的为诊断学。

由于WNV在人体的血液和组织中含量较低，所以通过体外扩增遗传物质可以提高WNV的检测率。依靠于实时PCR的检测技术可快速检测临床样品中的WNV。实时PCR技术是通过荧光信号对PCR进程进行实时检测。与普通PCR相比，实时RT-PCR因为它更快速，更敏感，更实时，并且使污染最小化。此外，实时RT-PCR易于标准化流程操作，可使核酸定量化检测。SYBR Green是一种用于双链DNA的简便、实惠的特异性染料。但SYBR Green的缺点是，它会与反应中的任何双链DNA结合，包括非特异性的PCR产物和引物。Papin等人开发了一种SYBR Green检测方法，它可以将不同WNV靶区变异的位点全部检出，而TaqMan检测方法会有47％的探针结合位点单核苷酸变异检测不出来。Johnson等人针对靶向NS5基因设计引物探针从而可以有效检测出WNV等一系列黄病毒属的黄热病RT-PCR检测方法。尽管含有SYBR Green的RT-PCR方法能够检测到WNV，但与TaqMan RT-PCR检测WNV特异性相比，其灵敏度要低得多。SYBR Green在一定程度上抑制了PCR反应，并且在熔融过程中因染料的再次结合使熔解曲线分析变得复杂。Eischeid分析了其他DNA染料在实时PCR中的效果，发现EvaGreen和SYTO染料13,16,80以及82在实时PCR中优于SYBR Green。

目前TaqMan探针和分子信标探针比较适合代替SYBR Green，它们都使用杂交探针并依靠荧光共振能量转移（FRET）进行定量的。Lanciotti等人开发出了首次用于快速检测人类临床标本中WNV的TaqMan qRT-PCR检测方法。与传统的RT-PCR试验相比，这种TaqMan RT-PCR更为灵敏，可以检测到少于1 PFU的病毒，而传统的RT-PCR检测极限为1 PFU的病毒^[2]。Chao等人开发了一种多重TaqMan RT-PCR，用于同时检测YFV，JEV，WNV和SLEV 4种不同的黄病毒，检测限分别为3.5,2,10和10 PFU/mL。Dyer等人还开发了用于检测SLE，WNV，登革热和TBE物种的多重TaqMan检测方法。Naze等人开发了一种多重实时RT-PCR检测方法，可用于从血浆样本中定量检测登革热病毒（DENV）和基孔肯雅病毒（CHIKV）。同时，利用同样的血液提取物和相同的扩增条件，还研制了针对WNV定量检测的实时RT-PCR检测方法。Jiménez-Clavero等人通过引入小沟结合剂（MGB），从而开发出一种改进的TaqMan实时RT-PCR。MGB除了作为淬灭剂外，还增加了探针与其靶序列之间的结合亲和力，而Lanciotti等人设计出了利用两种不同的探针可对所有的样品进行平行分析的TaqMan RT-PCR检测法。以上两种方法的敏感性均较好，均可以检测到所有基因组型，但是Kunjin株和基因组2型只能通过新型TaqMan-MGB实时PCR被检测出来。

分子信标探针，像TaqMan一样，也含有荧光染料和淬火染料。仅在淬灭染料与荧光染料直接相邻时才会发生。Lee等人开发了一种复合RT-PCR，即利用FAM荧光标记的分子信标探针对WNV检测^[3]，并使用一种带VIC标记的TaqMan探测器来进行内部控制，该实验对WNV具有很高的特异性，且与其他15种病毒没有交叉反应。

Grant-Klein等人结合RT-PCR与电喷雾质谱（ESI-MS）法在Ibis T5000上可以检测出蜱虫、蚊子的黄病毒^[4]。使用Ibis T5000分析出DNA并通过ESI-MS法确定PCR扩增出的碱基组成（AxGxTxCx）。Grant-Klein等人设计出能够检测出大部分黄病毒科的8对用于RT-PCR检测的引物探针。通过RT-PCR/ESI-MS法可以在血清、尿液中准确的检测到WNV，并且证明这些临床检验基质不会影响该病毒的检测。测定WNV的灵敏度约为2PFU/mL。

Rondini等人通过多重RT PCR和连接酶检测反应(LDR)^[5]，对WNV的两种基因组型进行了敏感性分析。多重PCR引物扩增出WNV cDNA的三个不同区域。每个PCR引物都包含1到3个退化位点以适应引物结合位点发生的微小序列变化。将LDR引物用于识别每个PCR扩增产物位点。LDR产品的检测也可以通过杂交到通用的DNA微阵列来实现。

PCR的诊断技术需要专业的设备和人员来进行操作，这对于现场诊断是十分困难的，而由Parida等人^[6]所建立的环介导的等温扩增(LAMP)检测，更符合临床现场的检验。LAMP法是一种“低成本、高精准”的基因扩增技术。即对靶基因上的六个区域分析设计、合成四条引物探针，恒温下利用DNA置换进行扩增反应。LAMP法的优点在于扩增反应温度可以在63℃和65℃之间的等温条件下进行，从而避免了对热循环仪的需求。Parida等人发明的RT-LAMP法可对WNV的检定具有高度特异性。

另一种适用于等温条件的检测技术是核酸序列的扩增（NASBA）法。Lanciotti等人为检测WNV和圣路易斯脑炎（SLE），开发了两种NASBA检测方法，即用电化学发光或6-羧基荧光素标记病毒特异性分子信标探针。NASBA 法可以在一个小时内做出快速诊断，其灵敏度与TaqMan检测的灵敏度接近。

西尼罗病毒仍严重威胁着公共卫生，特别是对年轻，老年人以及免疫功能低下的个体。目前还没有抗病毒治疗来治疗WNV感染，只能给予支持治疗。利巴韦林^[7]，干扰素-α和WNV特异性免疫球蛋白均是治疗WNV疾病的特效方法，但都尚未经过严格的临床测试。诊断检测已经有了很大的改进，可以快速检测出WNV的存在，但易出现交叉反应。对于我国来说WNV还是一种新型病毒，现在尚无很好的免疫防控屏障。所以WNV一旦传入我国的后果严重性是巨大的，因此做好防控技术储备是十分必要的。

参考文献

1. Beasley DW, Whiteman MC, Zhang S, Huang CY, Schneider BS, Smith DR,Gromowski GD, HIgGs S, Kinney RM, Barrett AD: Envelope protein glycosylation status influences mouse neuroinvasion phenotype of genetic lineage 1 West Nile virus strains. J Virol 2005, 79:8339-8347.

2. Dyer J, Chisenhall DM, Mores CN: A multiplexed TaqMan assay for the detection of arthropod-borne flaviviruses. J Virol Methods 2007, 145:9-13.

3. Parida M, Posadas G, Inoue S, Hasebe F, Morita K: Real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of West Nile virus. J Clin Microbiol 2004, 42:257-263.

4. Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T: Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res 2000, 28:e63.

5. Lanciotti RS, Kerst AJ: Nucleic acid sequence-based amplification assays for rapid detection of West Nile and St. Louis encephalitis viruses. J Clin Microbiol 2001, 39:4506-4513.

6. Linke S, Mackay WG, Scott C, Wallace P, Niedrig M: Second external quality assessment of the molecular diagnostic of West Nile virus: are there improvements towards the detection of WNV? J Clin Virol 2011, 52:257-260.

7. Beasley DW, Holbrook MR, Estrada-Franco J, Weaver SC, Tesh RB, Shope RE, Barrett AD: Use of a recombinant envelope protein subunit antigen for specific serological diagnosis of West Nile virus infection. J Clin Microbiol 2004, 42:2759-2765.