流感病毒检测中细胞培养法与实时荧光定量PCR法效果比较

流感病毒检测中细胞培养法与实时荧光定量 PCR法效果比较

1 赵军嵘 2 曾文 通讯作者

1 邵阳市疾病预防控制中心微生物检验科 422000

2湖南邵阳市中心医院感染科 422000

【摘要】目的：观察分析实时荧光定量PCR与细胞培养在流感病毒检测中的应用效果。方法：于2019年01月--2020年12月采集的2605例疑似流感样本作为课题对象，均进行实时荧光定量PCR检测、细胞培养检测。对比分析两种不同方法获得的阳性检出率。结果：细胞培养阳性检出率明显低于实时荧光定量PCR阳性检出率（p<0.05）。707例流感阳性样本中分离获得113株病毒，占比15.98%；1898例流感阴性样本中未分离获得病毒株，占比0.00%，实时荧光定量PCR法获得的流感阴性样本分离率明显低于阳性样本分离率（p<0.05）。根据细胞培养结果，实时荧光定量PCR特异性100.00%。结论：在流感病毒检测过程中，实时荧光定量PCR法具有更高的应用价值，操作简单、耗时快、特异度高，适合于常规病毒检测以及应急检测工作中。细胞培养有助于临床获取病毒株，以便于临床深入研究病毒基因特性、抗原性、耐药性。

【关键词】实时荧光定量PCR；细胞培养；流感病毒；检测效果

流感指的是流行性感冒，是因为人体感染流感病毒所致的一种呼吸系统疾病，在现代临床中普遍可见，具有发病率高、传播范围广、传染速度快等特点，可导致患者高热不退、全身酸软无力、疼痛不适、寒战，十分不利于患者安全健康。为了临床针对性治疗流感，有必要及时检测，深入分析流感病毒株的基因特性、构成、抗原性，以免流感大范围扩散^[1]。细胞培养、胶体金快速检测等技术，在现代临床应用广泛。实时荧光定量PCR相比于常规PCR而言，环保型更强，具有更高的特异性以及更强的自动化检测特点。此种技术以扩增形式，对每个循环产物的荧光信号产生作用，以此来增强信号，结束一个循环后，便会被信号收集，以便于临床通过荧光信号轻度的变化构建曲线图^[2]。此次研究以2605例疑似流感样本作为课题对象，对比分析了实时荧光定量PCR与细胞培养的检测价值，以供临床参考。

1.一般资料与方法

1.1一般资料

本课题纳入观察对象2605例疑似流感样本，纳入时间2019年01月--2020年12月，所有采集的疑似样本均在24h之内送检，若是24h之内无法送检，则需要存储于-70℃环境下。

1.2方法

所有疑似流感样本均进行实时荧光定量PCR检测、细胞培养检测，其中（1）实时荧光定量PCR检测。准备实时荧光定量PCR检测仪器（美国Thenmo公司ABI7500Fast）、来自于硕世生物科技有限公司的PCR反应试剂、流感病毒核酸提取盒（西安天隆公司的核酸提取试剂）。50℃环境下不断扩增30min，给予一次循环；然后在95℃环境下不断扩增5min，给予一次循环；再然后基于95℃环境下不断扩增10s，55℃环境下不断扩增40s，总共循环45次。收集荧光，基于55℃环境之下检测荧光信号强度。（2）细胞培养。根据2018年版《流行性感冒诊疗方案》提出的流感病毒分离鉴定要求，进行相应的操作。选取MDCK细胞,在流感样本的病毒培养液之中置入10000U/ml双抗，认真查看细胞变化，结合红细胞凝集试验，对流感样本的病毒培养液进行检测，如果红细胞凝集试验结果的滴度为1：8或者是超过1:8，进一步通过相关型别标准血清，开展HI试验（红细胞凝集抑制试验），明确流感病毒型别、亚型。

1.3数据统计处理

统计学软件以spss22.0版本为主，进一步检验分析本研究课题获得的计数信息，均以%（率）形式表述并实施X²检验，根据细胞培养结果，获得实时荧光定量PCR特异性与灵敏度，数据差异判定结果以P值描述，以（P＜0.05）表示统计学意义。

2.结果

2.1观察细胞培养与实时荧光定量PCR阳性检出率 见表1

细胞培养阳性检出率4.34%明显低于实时荧光定量PCR阳性检出率27.14%（p<0.05）。

707例流感阳性样本中分离获得113株病毒，占比15.98%；1898例流感阴性样本中未分离获得病毒株，占比0.00%，实时荧光定量PCR法获得的流感阴性样本分离率明显低于阳性样本分离率（p<0.05）。根据细胞培养结果，实时荧光定量PCR特异性100.00%。

表1 细胞培养与实时荧光定量PCR阳性检出率对比

2.2观察流感阳性样本与阴性样本分离率

经过实时荧光定量PCR阳性检出结果，其中707例流感阳性样本中分离获得113株病毒，占比15.98%（113/707）；1898例流感阴性样本中未分离获得病毒株，占比0%（0/1898）。其中流感阳性样本与阴性样本分离率差异显著（X²=17.376，p<0.05）。

2.3观察实时荧光定量PCR检测价值

根据细胞培养结果，实时荧光定量PCR特异性100.00%（1898/1898），详情见表2。

表2 实时荧光定量PCR检测价值分析

3.讨论

流感病毒具有较短的潜伏期以及极强的感染性特点，是一种普遍可见的RNA病毒，感染期间有可能会变异，一旦疏忽，便会暴发，威胁到社会安全^[3]。因此，有必要及时检测，及时高效控制流感病毒传播。单独进行胶体金快速检测方法，灵敏度偏低，临床应用受限。目前临床对于流感病毒检测过程中，虽然细胞培养比较可靠，但操作耗时长，过程复杂，不能满足应急检测需求，使其无法在基层医疗单位广泛普及^[4]。实施荧光定量PCR具有较高的特异性，能够对流感病毒进行自动化检测，以免样本污染。本研究对照观察，结果细胞培养阳性检出率4.34%明显低于实时荧光定量PCR阳性检出率27.14%（p<0.05）。分析流感样本分离率，结果实时荧光定量PCR法获得的流感阴性样本分离率0.00%明显低于阳性样本分离率15.98%（p<0.05）。根据细胞培养结果，实时荧光定量PCR特异性100.00%。充分肯定了实时荧光定量PCR检测价值。在反应体系之中，加入淬灭基团、荧光报告基团，反应时便会逐步升高扩增产物，产生大量的荧光信号，方便检验人员观察分析，根据荧光信号强度变化，明确PCR实施进程，与此同时，构建标准曲线，深入的定量分析^[5]。PCR反应过程包括荧光背景信号、信号扩增、平台期等三个阶段，第一阶段中会出现少量的荧光信号，极易被覆盖，影响检验人员观察；平台期的信号扩增情况比较稳定，变化不明显^[6]。信号扩增反应阶段，DNA模板直接关系着扩增产量。

总而言之，实时荧光定量PCR检测方法耗时短、操作简单、特异度高，值得现代临床将之作为流感病毒检测的首选方法。

【参考文献】

[1]李楠,李婕,李亚红,等.实时荧光定量PCR法检测肾移植术后BK病毒和JC病毒感染及临床意义[J].黑龙江医学,2019,43(11):1287-1289.

[2]卓丽,兰芸,李粤平,等.实时荧光定量PCR法对肝衰竭合并侵袭性肺曲霉菌病患者的诊断价值[J].实用医学杂志,2019,35(18):2946-2949.

[3]张艳奇.实时荧光定量PCR法在乙肝病毒DNA及血清标志物检测中的应用价值[J].黑龙江医药,2019,32(01):204-205.

[4]薛京昌,卞琛,徐晓怡.实时荧光定量PCR法在流感病毒暴发疫情病原学检测诊断中的应用[J].实用预防医学,2017,24(05):625-626.

[5]杜锴.实时荧光定量PCR法检测乙肝病毒DNA的价值分析与研究[J].中国现代药物应用,2017,11(01):55-57.

[6]韩毅,孙燕萍,周虹,等.实时荧光定量PCR法与分离培养法检测食品从业人员沙门菌和志贺菌的比较研究[J].中国食品卫生杂志,2015,27(02):132-135.

基金号：2020GZ106 邵阳市科技厅