臭氧空间消毒生物指示剂研究及运用

臭氧空间消毒生物指示剂研究及运用

王澄 董元霖

扬子江药业集团 江苏 泰州 225321

摘要：根据扬子江药业关于臭氧空间消毒生物指示剂研究案例，阐述臭氧空间消毒生物指示剂的制备方法和应用

关键词：臭氧、生物指示剂、白色葡萄球菌

引言

根据《消毒技术规范》（2002版），空间消毒臭氧浓度要求不低于20mg/m³（折算后约为10ppm），达到此浓度的消毒时间不低于30min，臭氧发生设备运行时间不低于2小时。目前公司在做臭氧消毒系统确认时，选择部分有代表性的功能间（换气次数低的功能间、处于风管末端的功能间、人员活动频繁的功能间、与洁净度等级低区域连通的功能间），确认该房间的消毒时间和消毒浓度符合要求，即臭氧浓度大于10 ppm的消毒时间应不低于30min，臭氧发生设备运行时间不低于2小时。因此从物理指标来讲，臭氧消毒能够满足要求，但未开展过杀菌效果的确认，无法判定臭氧的实际杀菌效果。下面笔者对扬子江药业对于臭氧空间消毒生物指示剂研究及运用展开阐述

1 生物指示剂介绍

目前市面上有各种生物指示剂，主要包含环氧乙烷灭菌用生物指示物、湿热灭菌用生物指示物、干热灭菌用生物指示物、过氧化氢低温等离子灭菌生物指示物和甲醛灭菌用生物指示物。由于微生物芽孢较菌体有更强的耐受性，因此一般生物指示剂均采用含芽孢的细菌制备。

鉴于臭氧空间消毒方法对于孢子类杀菌效果极其有限（笔者开展过小试，即便处于极高浓度下，依然很难杀灭），同时根据GB 28232-2020《臭氧消毒器卫生要求》和《消毒技术规范》（2002版），臭氧能够对白色葡萄球菌（8032）起到杀灭率≥99.9%的作用，因此选择白色葡萄球菌作为生物指示剂菌种，由于白色葡萄球菌不产生孢子，耐受性较差，无法制备成成品生物指示剂，因此需进行自制。

2 生物指示剂制备方法

通过对生物指示剂制备方法进行筛选，可采用菌悬液定量检测或者平皿培养的方法开展。此次选择的方法为平皿培养的方法，具体步骤和方法如下：

2.1 菌悬液的制作

准备试验菌：白色葡萄球菌8032、普通营养肉汤培养基、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液等。

对白色葡萄球菌进行复苏、复壮、传代，并制备适量的白色葡萄球菌菌悬液，菌悬液浓度应≥1×10³cfu/ml。

2.2 生物指示剂制备

生物指示剂需要现制现用，因此需在使用前进行制备，具体制备步骤如下：

（1）取所需数量的φ90mmTSA培养基，包含试验组、2个空白对照、2个阳性对照。

（2）取白色葡萄球菌悬液1ml加入含pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 ml的滤筒中，过滤，然后取出滤膜，过滤面朝上，贴于TSA培养基平板上，平行制备多个培养皿，用作试验组使用。

（3）将制备好的白色葡萄球菌菌悬液按照进行稀释，得到不超过100cfu/ml的白色葡萄球菌悬液。然后取该菌悬液1ml加入含pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml的滤筒中，过滤，然后取出滤膜，过滤面朝上，贴于TSA培养基平板上，平行制备2个培养皿，用作阳性对照使用。

3 生物指示剂使用

将制备好的试验组生物指示剂放入到已确定的摆放点位上。按照要求开启臭氧消毒，整体消毒完毕后，立即将经消毒的生物指示剂、阳性对照收取并放入30℃-35℃的培养箱内倒置培养不超过3天，培养结束后观察并点计出培养皿上的菌落数。

最终臭氧杀菌效果采用公式进行计算：（阳性对照组菌落平均数*N - 试验组菌落数）/（阳性对照组菌落平均数*N）应不小于99.9%。

4 结语

由于环境中会有杂菌干扰，因此在开展试验前，需要先对洁净区进行整体清场和消毒，去除环境中的杂菌。另外由于活菌引入洁净区，为避免活菌影响，开展此试验需车间停产并且在完成试验后需要做好洁净区整体的清洁和消毒。

参考文献

[1] 消毒技术规范（2002）

[2] GB 28232-2020《臭氧消毒器卫生要求》

[3]中华人民共和国药典 2020年版