液相色谱-串联质谱法LC-Ms/Ms测定蜂产品中氯霉素的残留量

液相色谱 -串联质谱法 LC-Ms/Ms测定蜂产品中氯霉素的残留量

周世雄 李镇宏 保嘉敏

（云南白药集团股份有限公司 云南昆明 650500）

摘要：本文建立了一种利用液相色谱-串联质谱法LC-Ms/Ms测定蜂产品中氯霉素残留量的方法。样本提取、净化后，经乙腈-水流动相体系洗脱，C18色谱柱分析后，利用三重四级杆液相色谱质谱联用仪灵敏度高、专属性强、定量准确来检测氯霉素，可以用来快速筛查蜂蜜和蜂王浆中的氯霉素残留。

关键词：LC-Ms/Ms 蜂蜜 氯霉素残留

氯霉素，作为一种广谱的抗菌药物，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、厌氧菌、立克次体属和衣原体属等抑制作用。^[1]根据《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》(农业部公告第193号)规定，氯霉素被禁止使用在食品、动物方面。^[2]若人们长期食用含有氯霉素的蜂产品，会导致人体再生障碍贫血，体内菌群失调，产生耐药性。^[3]因此，我们建立了利用三重四级杆液相色谱质谱联用仪测定蜂产品中氯霉素残留量的方法。

1. 仪器与材料

1.1 样品样品 蜂蜜 市售样品 、蜂王浆市售样品。空白样品：不加样品与供试品同法制得的供试品。

1.2.仪器 高效液相色谱-质谱联用仪：Thermo Fisher Ultimate RS 3000-Thermo Fisher TSQ-Endura三重四极杆液相色谱-质谱联用仪（配ESI源）。色谱柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD C18(1.9um ,100×2.1mm)。0.45um TPHF有机系样品滤膜。天平：赛多利斯电子天平（BSA224S-CW）（100g，0.01mg；220g，0.1mg）；梅特勒-托利多电子天平（MX5）(3g，0.001mg)。

1.3试剂 甲醇，色谱级，德国默克，I866507 650。乙腈：色谱纯，德国默克，JA046330。氨水，分析纯，广东光华科技股份有限公司，20170217。水，为GB/T6682中规定的一级水。氯霉素，中国食品药品检定研究院，批号：130555-200602，纯度：99.4%。

2. 试验方法

2.1 色谱、质谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂（Thermo Scientific Hypersil GOLD C18(1.9um ,100×2.1mm)），以水为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱：

进样量：2uL；柱温：30℃；质谱条件 离子源：电喷雾离子化（ESI） 负离子模式； 检测器：三重四极杆质谱检测器监测离子对及电压参数：a）喷雾电压：ESI-:3000V； b）雾化器压力：30units； c）辅助气压力：10 units； d）吹扫气压力：1 units； e）离子源温度：320℃； f）离子传输管温度：350℃； g）碰撞气及其压力：氩气，2mTorr。选择氯霉素的离子对321.7→258为定量离子对，选择321.7→153、321.7→177、321.7→195为定性离子对，选取动态多反应监测模式（SRM）。

2.2 标准工作溶液的制备

储备溶液：称取适量氯霉素标准物质，用甲醇配置成0.1mg/mL的标准储备液，存放于4℃的冰箱，使用前恢复至室温。使用前配置成标曲使用。

图1 氯霉素的子离子碎片选择图

2.3 蜂蜜供试品溶液的制备

1提取 取部分样品置于密封清洁的容器中，置于不超过60℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，冷却至室温，混合均匀后备用。取混合均匀的试样适量，取约5g，精密称定，置离心管中，加入5mL水，于涡旋振荡器上涡旋数分钟，使式样完全溶解。准确加入15mL乙酸乙酯，在振荡器上振荡10min，以3000r/min离心10min，准确吸取上层乙酸乙酯10mL蒸干，加入5mL水溶解残渣，待净化。

2净化 将上述待净化的提取液加入Welchrom®PS/DVB固相萃取小柱中（规格：60mg/3mL，使用前分别用5mL甲醇和10mL水预处理，保持柱体湿润），溶液以3mL/min的流速通过Welchrom®PS/DVB固相萃取柱，待溶液完全流出后，用2×5mL水淋洗Welchrom®PS/DVB固相萃取柱，弃去全部淋洗液，将残存于小柱上的液体吹出，静置10min。最后用5mL甲醇洗脱，收集洗脱液于5mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，供液相色谱-串联质谱仪测定。

2.4 测定法

分别精密吸取各标准工作溶液与供试品溶液各2μL，注入高效液相色谱-质谱仪，测定，以氯霉素的峰面积外标法计算，既得。

3. 方法验证

3.1 特异性试验

对空白样品和样品，按照2.3所述供试品溶液制备方法处理，进样检测分析，考察试验样品中除氯霉素以外的其他组分对氯霉素的测定有无干扰。

3.3 精密度试验

精密吸取氯霉素对照品溶液2μL，按测定方法重复进样6次，测定峰面积值。对各次测得的峰面积值求相对标准偏差值，用以说明仪器精密度情况，精密度为9.5%。

3.4 线性关系与线性范围考察

分别配制不同浓度梯度的氯霉素标准工作溶液，2μL注入高效液相色谱-质谱仪，按上述色谱条件测定峰面积；以峰面积为纵坐标，以氯霉素浓度为横坐标作线性回归，绘制标准曲线。得氯霉素线性回归方程。线性方程为Y=-31.5905+90.6766*X相关系数为R^2=0.9949

3.5 检测限和定量限的确定

为了验证该方法的检测限，将供试品进行10次测定，取10个数据，按照3倍标准偏差来计算检出限，当在实际测试中，样品中氯霉素均为未检出，故采用测试标准品的方法来间接的得到该方法的检测限和定量限，检出限（仪器检出限，3*SD）为0.3ng/mL，仪器定量限（10*SD）为1ng/mL。

3.7 重复性试验：

按照2.3所述供试品溶液制备方法平行处理6份供试品溶液，注入液相色谱-质谱仪测试，进行重复性试验，通过供试品含量进行数据分析。样品测试为未检出。

3.8 加标回收率试验（准确度试验）

采取全程加样法。取9份已知含量的蜂产品5g，精密称定，分别以标准中控制限水平进行加标试验，依法测定，并计算出蜂产品中氯霉素的含量。试验结果：平均回收率应为70.0%～125.0%，RSD为14.1%。

4. 讨论：

《GB/T 18932.19-2003 蜂蜜中氯霉素残留量的测定方法 液相色谱-串联质谱法》中要求使用Oasis®HLB（60mg/3mL）^[4]，实验室通过比较Oasis®HLB（60mg/3mL）与Welchrom®PS/DVB两种固相萃取小柱，经方法验证测试后，将固相萃取柱Oasis®HLB（60mg/3mL）替换为Welchrom®PS/DVB（100mg/6mL），经过回收率测试，Welchrom®PS/DVB（100mg/6mL）固相萃取柱能满足试验需求。

参考文献：

[1]江丽,刘倩,张新翠,龚春燕.12种抗菌药物对痤疮丙酸杆菌的体外抗菌活性研究[J].中华皮肤科杂志,2018,51(06):453-455.

[2].食品动物禁用的兽药及其它化合物清单[J].云南农业,2017(10):55.

[3]黄玉华.抗生素使用安全现状与抗生素残留检测技术研究进展[J].食品安全导刊,2014(11):34-35.

[4].蜂蜜中氯霉素残留量的测定方法 液相色谱-串联质谱法[S].GB/T 18932.19-2003

[5].进出口蜂王浆中氯霉素残留量的检测方法 液相色谱-串联质谱法[S].SN/T 2063-2008