用液相色谱法测定热毒清片中重楼皂苷Ⅶ ⅡⅠ的含量

用液相色谱法测定热毒清片中重楼皂苷Ⅶ ⅡⅠ的含量

李宁 张敏 李镇宏

（云南白药集团股份有限公司 云南昆明 650500）

摘 要： 目的：建立一个用液相色谱法测定热毒清片中重楼皂苷Ⅶ Ⅱ Ⅰ的含量测定的方法。方法：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 ；以乙腈–水为流动相进行梯度洗脱 ；检测波长为203mn，柱温30℃，流速1.0ml/min。结果：重楼皂苷Ⅶ在3.074176μg/ml-153.7088μg/ml度范围内线性关系良好，得线性方程y=2.7189x+0.2466（R2=0.9999）；重楼皂苷Ⅱ在1.4843μg/ml~74.217μg/ml之间呈良好线性关系，得重楼皂苷Ⅱ回归方程：y=2.8348x-0.0284

（R2=0.9999）；重楼皂苷I在2.8852μg/ml~144.13μg/ml之间呈良好线性关系，得重楼皂苷I回归方程：y=3.3478x+0.2496（R²=0.9999）回归系数均大于0.999； 结论：该方法简便、准确，可用于保健食品中褪黑素的质量控制。

关键词：热毒清片 重楼皂苷Ⅶ 重楼皂苷Ⅱ 重楼皂苷Ⅰ 含量 方法确认

热毒清片是由重楼、南板蓝根、冰片、蒲公英、甘草五味药组成的复方制剂，具有清热解毒，消肿散结。用于热毒内盛所致的腮腺炎、扁桃腺炎、喉头炎、上呼吸道感染等症。其中重楼具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊的功效，为主药之一。原质量标准中无【含量测定】控制指标，不能对投料药材及生产工艺进行有效控制。为保证药品质量可控，增加对重楼的【含量测定】质量控制。

1. 仪器与试药

1.1 仪器 美国Thermo UltiMate 3000高效液相色谱仪系统（配有紫外检测器、双三元泵、在线脱气装置、自动进样器、柱温箱）

1.2 试药乙腈、甲醇，色谱级，德国默克；水，超纯水。

2. 方法与结果

2.1 含量测定

色谱条件：以以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 ；以乙腈–水为流动相 按下表进行梯度洗脱；检测波长为203mn，柱温30℃，流速1.0ml/min。理论板数和分离度按重楼皂苷Ⅶ计算应符合要求。

时间（分钟） 流动相A（%） 流动相B（%）

0～40 30 70 40～50 30→60 70→40

对照品溶液储备液的制备 取重楼皂苷I, II, Ⅶ对照品适量于50ml容量瓶中，精密称定，加甲醇制成重楼皂苷I, II, Ⅶ浓度分别为144.13μg/ml、74.217μg/ml、153.71μg/ml的对照品混合储备溶液。

供试品溶液的制备 取本品20片，研细，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

精密度试验：分别精密吸取重楼皂苷I, II, Ⅶ混合对照品溶液（浓度分别为：166.0μg/ml、138.8μg/ml、191.4μg/ml）各10μl，按测定方法重复进样6次，测定峰面积值。

进样次数	重楼皂苷I峰面积	重楼皂苷II峰面积	重楼皂苷Ⅶ峰面积
1	558.924	389.221	524.406
2	559.760	389.784	523.571
3	558.458	388.399	524.789
4	549.191	381.776	515.437
5	549.743	382.552	515.438
6	550.918	383.160	516.761
平均峰面积	554.499	385.815	520.067
RSD（%）	0.91	0.96	0.90

线性关系与线性范围考察精密量取按上述对照品溶液制备方法制备的混合对照品储备溶液，分别精密量取对照品储备溶液5ml→25ml作为对照品溶液4，5ml→10ml作为对照品溶液5，分别精密量取对照品溶液4各1ml、2.5ml、5ml稀释至10ml作为对照品溶液1、2、3，以对照品储备溶液作为溶液6，分别取10μl注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积；以峰面积为纵坐标，分别以重楼皂苷I, II, Ⅶ对照品系列溶液浓度（μg/ml）为横坐标作线性回归，绘制标准曲线。

试验结果表明：重楼皂苷Ⅶ在3.074176μg/ml-153.7088μg/ml度范围内线性关系良好，得线性方程y=2.7189x+0.2466（R2=0.9999）；重楼皂苷Ⅱ在1.4843μg/ml~74.217μg/ml之间呈良好线性关系，得重楼皂苷Ⅱ回归方程：y=2.8348x-0.0284（R2=0.9999）；重楼皂苷I在2.8852μg/ml~144.13μg/ml之间呈良好线性关系，得重楼皂苷I回归方程：y=3.3478x+0.2496（R²=0.9999）。

重复性试验：取1批热毒清片，取供试品6份，依法测定。同时，取重楼皂苷I, II, Ⅶ混合对照品溶液同法测定，分别计算出重楼皂苷I, II, Ⅶ含量。RSD分别为2.5%、1.9%、1.6%。

加样回收率试验（准确度试验）

采取全程加样法。取已知含量的样品分别添加重楼皂苷I, II, Ⅶ对照品，按含量测定方法测定，同时取I, II, Ⅶ混合对照品溶液，依法测定，并计算出重楼皂苷I, II, Ⅶ的含量。以下式计算回收率，

回收率＝

试验结果，重楼皂苷I, II, Ⅶ的平均回收率为103.2%（RSD=2.8%）、96.4%（RSD=2.6%）、95.6%（RSD=2.0%）、。结果较满意，表明本法适用于本实验室。

三、结论

通过对热毒清片中重楼皂苷I, II, Ⅶ的含量测定方法进行系统适用性试验、精密度试验、定量限、线性关系与线性范围考察、重复性试验、准确度试验（加样回收试验），各项试验测试结果均能满足要求，仪器性能稳定，质控结果满意。

从以上数据可以看出用该方法检测热毒清片中重楼皂苷I, II, Ⅶ的含量，结果准确可靠，可以在本实验室运用此方法检测热毒清片中重楼皂苷I, II, Ⅶ的含量。

参考文献

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典 2015版(四部) [M].北京：化学工业出版社，2005.

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