浙江晖石药业有限公司 312300
摘要：(S)-(-)- N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙胺（CAS号：116817-84-6）合成工艺中用到多聚甲醛，导致最终生产的产品中有甲醛残留，甲醛在贮存过程中，易被氧化成甲酸，甲酸在《2020版中国药典四部0861残留溶剂测定法》中属于3类溶剂，需要控制残留量低于0.5%，且(S)-(-)- N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙胺用于生产合成原料药，残留的甲醛容易发生反应，产生其他杂质，故(S)-(-)- N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙胺中需要严格控制甲醛残留量。甲醛限度低，普通的滴定法受基质（样品）影响，无法准确定量，其次，甲醛在气相和液相上响应偏低，为提高方法灵敏度，考虑将甲醛用2.4-二硝基苯肼衍生成2，4-二硝基苯腙，通过HPLC检测方法测2，4-二硝基苯腙来检测甲醛含量，并对方法做全面方法学验证。
关键词：甲醛；2.4-二硝基苯肼衍生；HPLC检测方法；分析方法验证
方法背景
产品要求控制甲醛限度为0.1%，甲醛用2.4-二硝基苯肼衍生成2，4-二硝基苯腙，需要摸索衍生条件，以及衍生产物适合的液相色谱条件，在按《2020版中国药典四部9101分析方法验证指导原则》，完成一系列方法学验证，证明检测方法适用于控制此产品中甲醛残留检测。
衍生条件和液相色谱方法摸索
溶液配制
稀释剂：2.4-二硝基苯肼（0.6g/L），取2.4-二硝基苯肼300mg，精密称定，置流动相瓶中，量取500mL乙腈超声溶解，过滤备用。
乙酸-乙酸钠溶液（pH=5.0）：称取乙酸钠2.64g，精密称定，量取500mL超纯水超声溶解，再加入1.0mL乙酸，混匀，过滤。
空白溶液：量取3.0mL乙酸-乙酸钠（pH 5.0）加入10mL容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，密闭后置60℃水浴1h，放冷至室温。
对照品贮备溶液（10ug/mL）：称取约270mg的 37%甲醛溶液，精密称定，至100mL容量瓶，加超纯水溶解定量稀释至刻度，精密移取1.0mL上述溶液至100mL容量瓶中，加超纯水稀释定量稀释至刻度；
对照品溶液（1ug/mL）：移取1.0mL的对照品贮备溶液至10mL容量瓶中，加3.0mL乙酸-乙酸钠（pH 5.0）溶液后用稀释液溶解定量稀释至刻度，摇匀，密闭后移入60℃水浴锅进行衍生反应1h后，冷却至室温。
供试品溶液 (1mg/mL) ：称取供试品20mg，精密称定，至20mL容量瓶中，加入6.0mL乙酸-乙酸钠（pH 5.0）后用稀释液溶解定量稀释至刻度，密闭后移入60℃水浴锅进行衍生反应1h后，冷却至室温。
加标供试品溶液 (1mg/mL) ：称取供试品20mg，精密称定，至20mL容量瓶中，加入6.0mL乙酸-乙酸钠（pH 5.0），加入对照品贮备溶液2.0mL，用稀释剂溶解定量稀释至刻度；密闭后移入60℃水浴锅进行衍生反应后，冷却至室温。同时配置3份，分别衍生40min、60min和80min。
色谱条件摸索
预设色谱条件
色谱柱： | Agilent EC C18 (4.6×150mm, 4μm)或其他适宜的色谱柱 |
检测器： | DAD检测器 |
柱温： | 30℃ |
流速： | 1.0mL/min |
进样量： | 20μL |
运行时间： | 20min（可调整延迟） |
流动相： | 乙腈：水=（60：40）（v/v） |
将空白溶液和对照品溶液分别进样，全波长扫描，通过Waters Empower3软件处理，
发现衍生产品2，4-二硝基苯腙在3.18min处出峰，最佳吸收波长可定为360nm,目标峰理论塔半数11510，拖尾因子1.1，故方法可行。
将供试品溶液和不同时间加标供试品溶液分别进样，采集360nm图谱，可知供试品对
衍生反应无干扰，且60min和80min衍生的目标峰面积大小基本一致，约623823，加标标供试品溶液图谱中，目标物与其前后峰分离度远大于1.5， 10min后，无色谱峰洗脱出。
综合以上图谱分析，发现空白在目标峰处有一定干扰，空白在目标峰处的峰面积为5943，
经调查试验证明，此峰为衍生试剂2.4-二硝基苯肼（Adamas-beta）带入的，换阿拉丁的2.4-二硝基苯肼，空白在目标峰处的峰面积为2668，占限度0.1%对应对照品溶液中目标物响应峰面积（以600000计）的0.44%，即相当于样品中含有甲醛的量为0.0044%，故对样品检测结果几乎无影响，风险可控，视空白无干扰，方法可正常进入验证。
最终确定的衍生条件和色谱方法
色谱柱： | Agilent nifinily lab Poroshell 120 EC-C18 4μm,4.6*150mm |
检测器： | DAD检测器 |
柱温： | 30℃ |
波长： | 360nm |
流速： | 1.0mL/min |
进样量： | 20μL |
运行时间： | 10min |
流动相： | 乙腈：水=（60：40）（v/v） |
衍生时间： | 60℃水浴衍生1h |
方法学验证
仪器、试剂和色谱柱
十万分之一分析天平、液相色谱仪（2台）、水浴锅、pH计、色谱柱（2根）；2,4-二硝基苯肼、乙腈、无水乙酸钠、乙酸、超纯水、37%甲醛；(S)-(-)- N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙胺；
溶液配制
流动相：分别量取600mL的乙腈和400mL的水，混匀，超声脱气；
稀释剂、乙酸-乙酸钠溶液（pH=5.0）、空白溶液和对照品贮备溶液（10ug/mL）同2.1
项下；
对照品溶液（L4）：移取2.0mL的对照品贮备溶液至20mL容量瓶中，加6.0mL乙酸-
乙酸钠（pH 5.0）溶液后用稀释液溶解定量稀释至刻度，摇匀，密闭后移入60℃水浴锅
进行衍生反应1h后，冷却至室温。
供试品溶液 (1mg/mL) ：称取供试品20mg，精密称定，至20mL容量瓶中，加入6.0mL
乙酸-乙酸钠（pH 5.0）后用稀释液溶解定量稀释至刻度，密闭后移入60℃水浴锅进行衍生反应1h后，冷却至室温。
50%准确度溶液：称取供试品约20mg，精密称定，至20mL容量瓶中，加入6.0mL乙
酸-乙酸钠（pH 5.0）后，加入1.0mL准确度贮备溶液，用稀释液溶解并定量稀释至刻度；密闭后移入60℃水浴锅进行衍生反应，1h后，冷却至室温。同法制备3份。
100%准确度溶液：称取供试品20mg，精密称定，至20mL容量瓶中，加入6.0mL乙
酸-乙酸钠（pH 5.0），加入对照品贮备溶液2.0mL，用稀释剂溶解定量稀释至刻度；密闭后移入60℃水浴锅进行衍生反应后，冷却至室温。同法制备6份。
150%准确度溶液：称取供试品约20mg，精密称定，至20mL容量瓶中，加入6.0mL
乙酸-乙酸钠（pH 5.0）后，加入3.0mL准确度贮备溶液，用稀释液溶解并定量稀释至刻度；密闭后移入60℃水浴锅进行衍生反应，1h后，冷却至室温。同法制备3份。
专属性试验
操作
按“3”下的色谱条件，待系统平衡后，依次进空白溶液、对照品溶液、100%准确度溶液和供试品溶液检测，记录色谱图
可接受标准
空白应不干扰甲醛衍生物的测定（空白在甲醛衍生物处干扰小于对照品溶液目标物峰面积的0.1%）；甲醛衍生物峰理论塔板数不低于5000。
试验结果和结论
空白溶液不干扰甲醛衍生物的测定，样品中其他杂质不干扰甲醛的检测；定位溶液中甲醛衍生物保留时间与混合溶液中甲醛衍生物保留时间一致（3.18min）, 甲醛衍生物峰拖尾因子1.1，符合可接受标准的各项要求。
定量限试验
操作
根据对照品溶液中目标杂质峰的信噪比值，逐级稀释后进样，记录色谱图，直至目标峰杂质的信噪比接近10：1，将此时溶液中目标杂质的浓度作为定量限溶液。再分别配制6份对照品溶液逐级稀释至定量限溶液，衍生后进样。
按“3”下的色谱条件，待系统平衡后，依次进空白溶液、逐级稀释的溶液（各1针，至到信噪比接近10：1）、空白溶液和6份LOQ溶液，进行检测，记录色谱图。
计算公式
定量限溶液中甲醛的浓度= CRS1/稀释倍数
甲醛能被准确定量的量（ng）= CRS1/稀释倍数×进样体积(ul)
CRS1：对照品溶液中甲醛的浓度（ug/mL）
可接受标准
定量限溶液的信噪比≥10：1；
报告定量限溶液中各物质的浓度和量。
试验结果和结论
甲醛衍生物定量限溶液的浓度为0.0103 ug/mL，6份溶液的平均相应因子为，RSD为6.1%，信噪比S/N为86.7，仪器能准确定量甲醛的量为0.2058ng，相当于供试品溶液浓度（1mg/mL）的0.001029%，相当于限度浓度（1ug/mL）的1.029%。故本方法灵敏度高，可以准确测得甲醛的含量，符合可接受标准的各项要求。
线性试验
操作
线性溶液配制：分别移取对照贮备液适量，至相应的容量瓶中，分别加适量乙酸-乙酸钠（pH 5.0）溶液后用稀释剂溶解定量稀释至刻度，摇匀，密闭后移入60℃水浴锅进行衍生反应，1h后，冷却至室温，取空白溶液、各线性溶液从低到高依次进样1针检测，记录色谱图。
溶液名称 | 对照贮备溶液1（mL） | 乙酸-乙酸钠（mL） | 容量瓶（mL） | 浓度（ug/mL） |
L1（LOQ） | 同LOQ项下 | |||
L2（50%） | 1 | 6 | 20 | 0.5 |
L3（80%） | 2 | 7.5 | 25 | 0.8 |
L4（100%） | 2 | 6 | 20 | 1.0 |
L5（120%） | 3 | 7.5 | 25 | 1.2 |
L6（150%） | 3 | 6 | 20 | 1.5 |
计算公式
Y轴截距的绝对值与100%线性溶液峰面积的=Y轴截距的绝对值/AL4×100%
A L4：线性溶液L4甲醛衍生物的峰面积
可接受标准
空白应不干扰甲醛衍生物的检测（空白在甲醛衍生物处干扰小于LOQ）；
浓度与面积应成线性，X轴代表浓度，Y轴代表峰面积，线性相关系r≥0.990；
Y轴截距的绝对值与100%线性溶液峰面积的比≤25%；
试验结果和结论
名称 | 浓度（ug/mL） | 峰面积 | A/C |
L1（LOQ） | 0.0103 | 11950.8273 | 1161360.5364 |
L2（50%） | 0.5145 | 344514.3801 | 669586.1219 |
L3（80%） | 0.8232 | 556377.5521 | 675847.4917 |
L4（100%） | 1.0290 | 697734.5247 | 678046.2319 |
L5（120%） | 1.2348 | 846655.4866 | 685637.5193 |
L6（150%） | 1.5436 | 1060613.4153 | 687123.7357 |
RSD% | —— | —— | 25.9 |
线性方程：y = 685113.4122 x - 2373.0749 | 相关系数r（≥0.990）：0.9998 | ||
Y轴截距的绝对值：2373.0749 | |||
Y轴截距的绝对值与标准为100%时的浓度的比值：0.34% | |||
结论：甲醛衍生物在浓度0.0103μg/mL～1.5436μg/mL范围内，浓度与峰面积线性关系良好，符合验证要求。 | |||
准确度试验
操作
按“3”下的色谱条件，待系统平衡后，依次进空白溶液、对照品溶液1（3针）、对照品溶液2、供试品溶液1、供试品溶液2、3份50%准确度溶液、6份50%准确度溶液、3份50%准确度溶液、对照溶液1检测，记录色谱图。
计算公式
对照品溶液2回收率=ARS2×MRS1/ ARS1/ MRS2×100%
甲醛含量（%）=Au×CRs1/ARS1/CU ×100%
响应因子RF=ARS1/CRS1
供试品中含有甲醛的量（ug）=AS×V1 / RF
准确度溶液中甲醛的回收量（ug）= Aaccuracy/ RF×V2
杂质的加入量（ug）=Caccuracy Reserve×V3
回收率%=(准确度溶液中甲醛的回收量-供试品中甲醛的回收量) /加入量×100%
ARS1 ——三针对照品溶液1中甲醛衍生物的平均峰面积
ARS2 ——对照品溶液2中甲醛衍生物峰面积
MRS1 ——对照品溶液1的重量（mg）
MRS2 ——对照品溶液2的重量（mg）
Aaccuracy：准确度溶液中甲醛的峰面积；
ARS1：3针对照品溶液1中甲醛的平均峰面积；
Au：供试品溶液中甲醛的峰面积；
CRS1：对照品溶液1中甲醛的浓度，ug/mL；
C Accuracy Reserve：准确度储备液中甲醛的浓度，ug/mL；
V1：供试品的容量瓶体积，mL；
V2：准确度溶液的容量瓶体积，mL；
V3：加入对照品贮备溶液的体积，mL；
可接受标准
空白应不干扰目标物的检测；
对照品溶液1连续进样3针，甲醛衍生物峰的峰面积RSD≤1.0%；
对照品溶液1中，甲醛衍生物主峰理论塔板数不低于5000；
对照品溶液2中甲醛衍生物峰峰面积的回收率，90.0%~110.0%；
供试品溶液进样后，对照品溶液1中甲醛衍生物峰面积的回收率90%~110%；
各准确度溶液回收率应在80%~120%范围内。
实验结果与结论
系统适用性均符合要求 | ||||||
溶液名称 | 原有量（ug） | 加入量（ug） | 测得量（ug） | 回收率（%） | Average (%) | RSD (%) |
50%准确度溶液 | 0.0000 | 10.1321 | 8.9157 | 88.00 | 85.31 | 2.7 |
0.0000 | 8.5050 | 83.94 | ||||
0.0000 | 8.5099 | 83.99 | ||||
100%准确度溶液 | 0.0000 | 20.2641 | 17.7084 | 87.39 | 90.22 | 2.9 |
0.0000 | 18.7641 | 92.60 | ||||
0.0000 | 18.3759 | 90.68 | ||||
150%准确度溶液 | 0.0000 | 30.3962 | 28.6592 | 94.29 | 94.17 | 1.1 |
0.0000 | 28.2999 | 93.10 | ||||
0.0000 | 28.9128 | 95.12 | ||||
9份回收率的平均值(%)：89.9 | 9份回收率的RSD(%)：4.7 | |||||
结论：符合验证要求，本方法回收率良好，准确度高。 | ||||||
精密度实验
操作
按“3”下的色谱条件，两名分析员分别配制各溶液，使用不同仪器和色谱柱，待系统平衡后，按依次分别进空白溶液、对照品溶液1（3针）、对照品溶液2、6份100%准确度溶液、范进对照品溶液1检测，记录色谱图。
中间精密度试验同重复性项下，换不同分析员、不同仪器、不同色谱柱试验。
计算公式同4.6.2
可接受标准
系统适用性考察同4.6.3；
供试品溶液进样后，对照品溶液1中甲醛衍生物峰面积的回收率90%~110%；
6份重复性100%准确度溶液的检测结果RSD≤5.0%；
中间精密度，两名分析员12份100%准确度溶液检测结果的RSD≤10.0%。
实验结果和结论
分析员1重复性实验，6份100%准确度溶液回收率平均值为90.7%，RSD为2.3%；
分析员2使用不同仪器、不同色谱柱做中间精密度实验，6份100%准确度溶液回收率平均值为98.6%，RSD为0.23%；2人12份100%准确度溶液回收率平均值为94.5%，RSD为4.6%，均符合验证各项要求，方法中间精密度良好。
溶液稳定性
操作
按“3”下的色谱条件，待系统平衡后，分别按0h、0.5h、1h、2h、3h、5h和6h进对照品溶液1和100%准确度溶液，记录色谱图，通过甲醛衍生物峰峰面积变化考察溶液稳定性。
可接受标准
对照品溶液1和100%的准确度溶液在室温下，密闭保存，分别于不同时间内进样，甲醛峰的峰面积与0h峰面积相比较，相对偏差在±10%范围内。
实验结果和结论
对照品溶液0~3h内，5次不同时间进样考察，甲醛衍生物峰的峰面积与0h的相比，最大相对偏差为1.1%；100%准确度溶液0~3h内，5次不同时间进样考察，甲醛衍生物峰的峰面积与0h的相比，最大相对偏差为4.6%；
结束语：
综上所述，用于药品检验的分析方法，均需要经过系统的理论知识，结合样品本身的工艺分析，制定合理的质量控制指标，结合试验，通过系统的分析方法学验证后，才能将方法用于日常质量监控，确保日常药品检测数据的准确性。
参考文献：
[1] 《中华人民共和国药典》2020年版四部，9101分析方法验证指导原则
[2]马庆国、徐锦宏、何伟、闫伦彤、赵晓红 2.4-二硝基苯肼衍生化甲醛条件探讨CNKI:SUN:SDHG.0.2018-21-006
6
客服QQ：30444492琼网文【2021】1550-113号
增值电信业务经营许可证：琼B2-20210322
出版物经营许可证：新出发龙华出字第(2021)009号
广播电视节目制作经营许可证：(琼)字第00779号
版权所有 ©2002-2024 期刊网 琼ICP备2021005105号
