荧光RT—PCR检测活禽和禽组织中禽流感病毒的研究

荧光RT—PCR检测活禽和禽组织中禽流感病毒的研究

罗敏

万源市疾病预防控制中心   636350

摘要：实时的荧光RT—PCR检测技术，是在常规PCR平台上发展出来的量化PCR工艺技术，通过在PCR的反应系统中添加了大量荧光反应基团，之后再经过大量荧光数据的积累，就可以即时的监控了整个PCR流程，之后又利用x射线断层成像数据的标准曲线，对所有未知模型都实现了定性分析。

关键词：RT—PCR；活禽和禽组织；禽流感病毒；研究

目前中国国内对禽流感的鉴别与检测，大多采取病原分离方法和血清学检测.虽然病原分离方法是一个比较准确的检测方式，但由于具有费时太远、操作程序复杂等弊端，因此无法广泛应用在对禽流感的快速监测上.而血清学方法大多用于测定抗体水平，而目前正在大量应用疫苗的状况下，也制约着这种方式的广泛应用.所以，寻求一个迅速、灵敏的检测技术用于测定动物及产品中的禽流感病毒，已成为当前中国禽流感检测工作的主要当务之急.荧光RT-PCR技术是指使用由A型流感病毒共有基因组特异序列所制备的一个特异性引物，与一个特殊的荧光双标探测器发生PCR反应，再利用检测器所吸收的荧光值来确定结果.该技术具备迅速、灵敏、特异、精确、安全和使用简便等优势，已成为当前检验禽流感的重要标准，由国家市场监督管理局按照规定在全国所有的大中型家禽产品出口公司所在地的政府直属部门试行.但因为该种技术所用的仪器设备和试剂都比较价格昂贵，所以目前普及使用还有相当难度.为了如何衡量该种技术和常规方法之间的相互关系及其它们技术上的相似性，本试验所分别使用了俩种禽流感的通用RT-PCR方式，对禽流感H9亚型病毒及实际样品开展了检验，以期在快速、敏感度、特殊和实用性等领域开展了对比，为禽流感检验办法的制定提出了理论依据。

1.禽流感病毒分型及病原结构和特点

禽流感,是由A型流感病毒所导致的一个禽类病毒性综合征。因为它从1878年开始在德国蔓延,当时被人们称为“鸡瘟”。禽流感病毒一般根据其致病性分成高致病性禽流感病毒、低致病性禽流感病毒和不致病性禽流感病毒。通过血凝素和神经氨酸酶把A类流感病毒分为以下几种亚型,已发现的有15个血凝素HA亚式和9个神经氨酸酶NA综合征亚型。但随着宿主、隔离株、免疫状态及是否存在继发感染的不同,感染家禽的临床表现也有很大差异,包括无症状毒性、亚临床表现、轻度呼吸道疾病、产蛋量减少或急性致命性疾病[1]。

禽流感病毒在全球范围内分布很普遍,但大部分禽流感病毒均为隐性感染,并不显示其临床特点;而有少部分禽流感病毒产生了传播速度快、致死力强的特征,从而构成高致病性禽流感。是严重威胁家禽业的主要传染病之一。国外兽医部门已将其列入甲类传染病,中国已将其列入甲类传染病检测范围。中国是从20世纪90年代开始的。曾有几次从发病鸡群中成功分离出A型流感病毒,特别是近年来,趋势迅速扩大,禽流感给我国养鸡生产带来了极大的损失,尤其是高致病性的H5Ⅱ型和部分H9亚型禽流感病毒,不仅给养鸡生产造成严重损害,甚至给我国家禽出口也带来了很大的麻烦,是限制家禽出口的主要问题之一。

1.实时荧光定量PCR原理：

1.1SYBRGreen法：

SYBRGreen是一类与双链DNA的光融合染料，在游离态时并不感光，但同时并没有特别地参与到在双链DNA中所形成的荧光信息中，其亮度也和双链DNA的数量直接有关，但同时由于扩增物质数量的增多，其所测量到的荧光信息总量也会增加[2]。

1.2分子信标法：

探针结构是与茎环结合的发簪型，环上的核苷酸顺序与序列扩增产生互补，在二端产生了互补的核苷酸顺序曲线，并标记了反馈基团，在末端标记了猝灭，探针之前不能与模板结合，由于探针之前并没有与模板结合，所以对反馈基团的荧光信息只有在与模板结合后，使探针的结构才从发簪式转化为弹性链式结构，使反馈基团与淬灭基团分离，从而检测荧光信号。

2.操作步骤

2.1样本的处理（在样本处理区进行）

按照咽拭子标本的数量多少,统计拟制备的裂解液和磁性混合物的总量,即待测样本+阴性对照+A对照+B对照+另一个样本量。1:先添加12mL的无水异丙醇于洗涤水中。一瓶。摇匀后,常温储存；2:先添加约32ml的无水乙醇于洗涤液conc2瓶内。摇匀后以室温条件保存。摇拭量2min为宜,取上水清约50µl后进行核酸扩增试验。将残留溶液封存于-80℃。

2.2配制裂解/结合液

每反应1ulCarrierRNA，每反应65ulLysis/BingingConc.，每反应65ul无水异丙醇。摇匀后常温储存使用。

2.3配制磁珠混合液

每反应10ulLysis/BingingEnhance，每反应10ulRNAbindingBeads。混匀后4℃保存使用。

2.4裂解/结合

U型板上，顺次注入20ul磁珠混合物、50ul预处理过的样品、130ul裂解/结合液等。使漩涡在多谐振荡器上轻微地振动了大约五分钟，以实现将溶液混匀和与核酸的扩增或融合。将U型板移至96孔磁板上，用低温放置约三分钟后。可使U型板保持在磁板上，并除去其上清液。

2.5洗涤液1洗涤2次：

将U型板从磁性板上拿下，然后加入150微升洗涤液一，在漩涡中震荡三十秒后将U型板置于96孔磁性板上，再放置大约2分钟。将U型板固定在地磁板上，然后移去上清液并加入约150微升洗涤液，再重复洗涤一次。要尽量地吸干上清液[3]。

2.6洗脱

从地磁板上将U型板取下，剩下的溶剂利用旋涡震荡两分钟使其充分挥发。然后再向里面投放大约50毫升的ElutionBuffer，旋涡再震荡约三分钟。将U型板移入96孔的磁盘中，并放置约四分钟。将纯化过的核酸扩至上清液中，并直接进行PCR或放在洁净的离心管上-20℃保存。

3.小结与讨论

PCR或RT-PCR已广泛应用于禽类疾病的诊断，但传统的分子诊断方法存在操作复杂、耗时、易污染、非特异性和定量困难等缺陷。实时定量PCR技术的发展解决了许多问题。在以前的报道中，水解探针被广泛使用。在本研究中，在保证特异性和敏感性的前提下，单次标记引物的成本低于水解探针和分子信标。

采用传统的RT-PCR方法，电泳扩增产物约为100bp。扩增产物溶解曲线只有一个峰值，说明引物自身荧光猝灭性能良好，不产生特异性信号，有利于AIV的检测。实验中，引物浓度对RT-PCR有较大影响。当标记引物的浓度达到250nM，未标记引物的浓度达到400nM时，检测到的荧光信号强度也达到一定的高值。因此引物浓度为300nM~400nM比较合适。

CT值是决定检测结果的关键。在试验中，首先确定阈值高度为基线范围内荧光信号强度标准差的10倍，基线范围一般为第3~15个周期。实验中，H9和H5亚型AIv的CT值均小于35，而IBV、NDV、IBDV和REV的CT值均大于35。结合PCR扩增特点，确定CT临界值为35，CT值小于35为阳性。CT值大于35被认为是阴性。

质粒拷贝数与荧光域值周期数的相关性表明，建立的PCR方法效率高，实验重复性和准确性好，检测到的质粒拷贝数可达3.6×102.4分子，在冲积液中检测到的AIVRNA至少可达lO17稀释度。有报道地高辛探针或传统的RT-PCR检测禽流感病毒核酸的下限为5-10pg(约105个病毒基因拷贝)。

禽肉在进出口贸易中必须进行严格的抽样检验，因此需要对禽肉组织进行快速检测。本试验分别对30份鸭肉和鸡肉样品进行检测，阳性检测符合率与病毒分离符合率一致。用鸡胚分离病毒是禽流感病毒检测的经典方法，对病毒分离后还要进行血清学或免疫学方法确实进行，其周期长，操作繁琐，大约需要在21天才能完成。本实验采用一步式RT-PCR反应体系，整个实验可在4h内完成，特异性和敏感性均满足设计要求。结果表明，该方法可用于禽流感病毒感染禽群和禽肉的快速检测。

【参考文献】

[1]王素春，仲焕香，姜楠，等.H5，H7和H9亚型禽流感病毒四重荧光RT-PCR检测方法的建立与应用[J].畜牧兽医学报，2020，51(6):9.

[2]周珊珊，吴健昌，万庆文，等.应用三重荧光RT-PCR方法检测H5，H7，H9亚型禽流感病毒核酸[J].畜牧兽医科技信息，2020(4):2.

[3]包红梅，田国彬，曾显营，等.H10N8亚型禽流感病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2020，42(12):6.