DNA倍体分析在宫颈细胞检测中的应用

DNA倍体分析在宫颈细胞检测中的应用

辛腾龙,赵新庆,王璐瑶,屈克诚

山东协和学院 山东 济南  250109

摘要：宫颈癌也称子宫颈癌，指发生在子宫阴道部及宫颈管的恶性肿瘤，是女性常见恶性肿瘤之一，发病率位于女性肿瘤的第二位。全世界每年大约有20万妇女死于这种疾病。 发病原因目前尚不清楚，早婚、早育、多产及性生活紊乱的妇女有较高的患病率。初期没有任何症状，后期可出现异常阴道流血。目前治疗方案以手术和放射治疗为主，亦可采用中西医综合治疗，但中晚期患者治愈率很低。

经临床追踪观察显示，从一般的宫颈癌前病变发展为宫颈癌大约需要10年时间。从这个角度看，宫颈癌并不可怕，它是一种可预防、可治愈的疾病。防治的关键在于：定期进行妇科检查，及时发现和治疗宫颈癌前病变，终止其向宫颈癌的发展。如能落实防治措施，宫颈癌的治愈率很高。

关键词：DNA倍体分析；细胞周期；宫颈癌细胞检查

1.什么是DNA倍体分析技术

1.1什么是倍体分析

DNA倍体是指遗传物质DNA的倍数。正常人静止期的体细胞都有23对，共46条染色体，每条染色体上的遗传物质DNA，都有一个同样的备份，即等位基因。也就是说，正常人的体细胞在非分裂情况下都是二倍体。在一些疾病状态下，例如恶性肿瘤患者，由于肿瘤细胞的DNA含量出现异常，会导致超二倍体、三倍体，甚至四倍体、八倍体等多倍体的出现，就是DNA倍体的异常。在几乎所有的癌症中正常细胞仍然是“整倍体”，而肿瘤细胞是“非整倍体”。关键的一点是，非整倍体是一般癌细胞的特征，在子宫颈癌的例子中，非整倍体出现“癌前病变”的阶段以及后来的浸润癌。一般来说，检测非整倍体细胞就是检测癌细胞。

1.2 DNA倍体检测技术

DNA倍体测量的是细胞核的总DNA含量，不能识别或计数单个染色体，严格意义上讲，它不是DNA或基因检测。测量到的每个细胞核的DNA含量与测量到的正常细胞群体的平均DNA含量进行比较，DNA含量是正常细胞2.5倍的细胞可靠地确定为非整倍体，虽然不能说细胞有115条染色体。

DNA倍体检测的核心理论就是比尔定律，与分光光度计测量DNA浓度的化学本质是相同的。光通过狭缝形成光束，定向到单色仪上，一种特定的颜色由另一个狭缝选择，光束穿过细胞，吸收部分光，剩下的光用感光元件检测。这样DNA的 浓度可以通过比尔定律测量。实际上，就是一个“超级显微光谱仪”——也就是数以百万计的像素大小的光谱仪。细胞核中存在的总DNA是通过将该细胞核图像中每个像素测量到的DNA相加得到的。

2. DNA倍体和细胞周期分析

细胞的生命周期开始于产生它的母细胞的分裂，结束于它的子细胞的形成，或是细胞的自身死亡。通常将子细胞形成作为一次细胞分裂结束的标志，细胞周期是指从一次细胞分裂形成子细胞开始到下一次细胞分裂形成子细胞为止所经历的过程。在这一过程中，细胞的异常物质复制并均等分配给两个子细胞。细胞周期分为间期和分裂期（M期）两个阶段，间期细胞经历DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期或有丝分裂前期（G2期）。处于细胞周期不同阶段的细胞DNA含量不同，处于G0和G1期的细胞含有二倍至四倍过渡的、不等的DNA量，而处于G2和M期的细胞含有四倍的DNA量。通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个周期时相的分布状态，计算出G0/G1%、S%及G2/M%，了解细胞的增殖能力。

细胞周期和DNA倍体广泛应用于肿瘤基础研究和临床医学中，为肿瘤的诊断、治疗和预后判断等提供重要的参考指标。恶性肿瘤细胞的重要特征之一就是细胞无限制生长、细胞核增大、核内染色质增多，其实质就是细胞核内DNA不断异常复制。非整倍体、高倍体或低倍体等异常倍体与细胞恶性程度相关，但并非所有肿瘤细胞特别是恶性血液病细胞不一定都有倍体的异常。有异常DNA含量的细胞其DNA倍体异常与肿瘤的发生、发展密切相关，测定DNA倍体对恶性肿瘤的程度判定、治疗方案选择及预后判断具有重要价值。另外，正常细胞在衰老过程中的多倍体化以及肿瘤治疗后导致的DNA含量增加，凋亡和坏死导致的DNA含量降低。

3.方法与标准

3.1标本采集方法

标本采集方法：妇科医师将宫颈刷头中央较长刷丝从宫颈外口插人宫颈管内，两侧短刷丝在宫颈粘膜面旋转3.5圈，取下宫颈刷头并浸泡在样本收集管中固定，送病理科行TCT及DNA倍体分析检测。在被检者子宫颈移行带用Dacron棉签旋转3圈，停留10s后取出，放置HPV标本收集管，送检验科行HPV-DNA检测（HC.Ⅱ）。所有病例均在阴道镜检下对可疑病变部位及宫颈移行带区3、6、9、12多点活检。

3.2诊断方法及标准

TCT 采用TBS细胞学分级系统，以ASC.US及其以上病变定为细胞学阳性。HPV-DNA应用PCR荧光法检测法，检出高危亚型为阳性。DNA倍体定量分析运用AcCell系统诊断软件，将细胞核DNA指数大于2.5的细胞定为DNA异倍体细胞，判断标准：未见DNA倍体异常细胞、可见少量DNA倍体异常细胞（1-2个）、可见DNA倍体异常细胞（3-15个）、可见大量DNA倍体异常细胞（≥15个）。将DNA倍体异常细胞≥3定为DNA倍体分析阳性。组织病理学均由2位高年资病理医师进行诊断，以意见相同者为准

3.3检测报告

报告的内容主要是三个图一个表，（1）X轴为DNA指数、Y轴为细胞数量的图，提示DNA标准化尺度是否有效。标准化尺度称为“DNA指数”或“DI”，其中二倍体细胞DI = 1，四倍体DI = 2，等等。绿峰代表纯二倍体，用于检查DNA测量线性。可以说，DNA指数是用于癌症筛查的自然尺度，主要涉及体细胞的二倍体偏离。（2）X轴为DNA指数、Y轴为细胞核面积的图，可查看每个检测的细胞的DNA指数与细胞核的面积，更加直观得观察到DI≥2.5的细胞。（3）表记录白细胞、上皮细胞数量及倍性细胞的百分比例。表下的5C和2.5C的C是DNA的“C-index”尺度，其中DI = 1为“2C”，DI = 2为“4 c”等，记录C≥5C和2C的百分比。检测结果及建议都在表下，本报告发现DNA倍体异常细胞，建议结合细胞学TBS后活检。（4）显示细胞核照片及DI指数的图，可以进一步的判断，是否是干细胞或增殖细胞，或者存在细胞核的重叠。

总结

随着细胞学检查结果级别的升高，DNA异倍体细胞的比例也不断升高。在细胞学结果为ASCUS中，有DNA异倍体细胞的比例为46.82%，而在细胞学结果为HSIL中，存在DNA异倍体细胞的比例高达100%。TCT诊断CINⅡ+（宫颈高度病变及宫颈癌）的敏感度为57.6%，准确度为50.8%；DNA倍体分析诊断CINⅡ+的敏感度为80%，准确度为56.9%。

细胞DNA定量分析技术主要通过对细胞核内DNA含量或倍体的测定来判断细胞的生理状态和病理改变。目前主要是使用全自动DNA图像分析系统（DNA-ICM）。定量分析细胞DNA具有如下特点：①检测细胞核内的相对DNA含量，而不是绝对值。常用c（content）作为单位来衡量DNA的含量。1个c为正常G0/G1细胞DNA含量的一半。②Feulgen染色使DNA特异性着色。其染色的深浅与DNA的含量成正比。③通过测量光密度（灰阶）计算被测细胞细胞核的积分光密度值(IOD, integrated optical density)。④用DNA指数来表示DNA含量。DNA指数=被测细胞DNA IOD值/正常细胞DNA IOD平均值。⑤由于淋巴细胞内DNA含量及形态较为稳定，细胞DNA倍体分析时常用同一标本的淋巴细胞作为标准对照。⑤分析每个细胞的DNA含量，并用DNA直方图，散点图显示标本恶性度。按细胞DNA含量高低，由高到低自动排序，将核酸含量高的前20个细胞核酸含量值直接报告，高于正常值为癌变细胞。

参考文献

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2. 洪琴，罗新.宫颈细胞DNA倍体分析检测宫颈病变的临床价值[J]. 2015.

3. 韦玮、莫可良、曾定元、谭广萍.TCT、HPV-DNA及DNA倍体在早期宫颈病变检测上的应用探讨[J] .2014.