复方青钱柳铬粉的安全性毒理学实验研究

复方青钱柳铬粉的安全性毒理学实验研究

柯兰兰1，高聪捷2，张乐平3

（1.福建医科大学基础医学院，福建 福州 350108；2.厦门市第二农场，福建 厦门 361024;3.南京林业大学，江苏 南京210037）

摘要：目的在于观察复方青钱柳铬粉的安全性。方法 按《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)之毒理学检验方法，进行小鼠急性毒性试验、Ames实验、小鼠骨髓细胞微核试验及大鼠30 d喂养试验。结果 复方青钱柳铬粉对雌雄小鼠急性经口的最大耐受剂量MTD均大于10.0 g/kg·bw，属实际无毒级。Ames实验、小鼠骨髓细胞微核试验结果均为阴性。大鼠30 d 喂养试验结果，各个剂量组大鼠各项指标与对照组比较均无显著性差异。结果显示复方青钱柳铬粉属实际无毒级，安全性较高。

关键词：青钱柳叶；葛根；铬；毒理；安全性

Safety and Toxicological Study on Compound powder of Cyclocarya paliurus and chromium

Abstract: To study the safety of compound powder of C. paliurus and chromium, the acute toxicity test, Ames test, bone marrow cell micronucleus test on mice and the 30-day feeding test on rats were carried out according to the toxicological test method of Technical Standards for Testing & Assessment of Health Food (2003). As a consequence, the maximum tolerated dose (MTD) of compound powder of C. paliurus and chromium to both male and female mice was greater than 10.0 g/kg·bw, which was non-toxic. Besides, the results of Ames test and bone marrow cell micronucleus test were negative, and no significant difference was observed in each dose group compared with the control group in the 30-day feeding test. Altogether, our data suggests that the compound powder of C. paliurus and chromium was actually non-toxic and had high safety.

Keywords:Cyclocarya paliurus leaves; Pueraria lobata roots; chromium; toxicological; safety

青钱柳系双子叶植物纲(Dicotyledoneae)胡桃科(Juglandaceae)青钱柳属（Cyclocarya Iljinsk.）的单一属种植物，其拉丁文命名为Cyclocarya paliurus (Batal.) Iljinsk，[1]。青钱柳被称为植物界的大熊猫，是冰川世纪的孑遗树种[2]，是中国特有的单种属植物，属于国家二级保护树种，被誉为医学界的第三棵树[3]。青钱柳叶片常被用于清热消肿、生津止渴，老百姓亦习惯把其当茶饮[4]，被誉为降糖神茶。据《全国中草药名鉴》记载：“青钱柳树叶、树皮及其根，能杀虫止痒，有消炎、止痛、祛风之功效”［5］。现代科学研究表明，青钱柳具有有降血糖、降血压、降血脂等多种药理方面的作用[6-7]，其化学成分含量丰富，目前已分离获得的成分有鞣质、逆没食子酸、黄酮及其苷类、多糖类、三萜及其苷类、酚酸类和无机元素类等[5]。

葛根系豆科植物(Leguminosae)野葛（Pueraria Llohbata (Willd) Ohwi）的干燥块根[1]，《神农本草经》记载其性味甘、辛、凉，入脾、胃经；具发表解肌、升阳透疹、清热生津、止泻等功效[8]。科学研究发现葛根的主要功效成分有葛根素、葛根黄酮、皂苷类等[9]。药理研究表明，葛根素可降低心肌耗氧量、改善局部微循环障碍，降低血糖，还可提高视觉功能等[10]。随着葛根功能因子不断被人们所研究和发现，葛根的保健作用也日益被人们所认识。

铬是人体必需的微量营养元素之一，是人体内葡萄糖耐量因子（glucose tolerance factor，GTF）的重要组成成分。在有机铬制剂中，富铬酵母具有生物活性高、毒性小、生产成本低等优点，在作为预防和治疗糖尿病药物的重要功效成分方面受到了人们重视。富铬酵母中含有生物活性较高的有机铬，能改善生物体内的糖代谢和脂肪代谢，有效降低糖尿病人的血糖和血脂

[11]。

本文以青钱柳叶、葛根浸提浸膏干粉和富铬酵母混合，得到复方青钱柳铬粉。本研究以复方青钱柳铬粉为试验材料, 依据保健食品检验与评价技术规范(2003年版)之毒理学检验方法，对其进行安全性试验评价。

1 材料

1.1 受试物 实验室自制的复方青钱柳铬粉，批号ZH201902。

1.2 制备工艺 以等比例青钱柳叶、葛根混合浸泡提取，用90℃热水，浸提2次，每次2h，合并滤液、过滤、干燥，得浸膏干粉。干膏粉得率为12.83%。94份干膏粉加6份富铬酵母混合均匀，得受试物复方青钱柳铬粉。

1.3 试验动物及环境清洁级昆明种小鼠70只，雌雄各半，体重19～22 g；Wistar大鼠40只，雌雄各半，体重70～80 g。试验用动物购自厦门万泰沧海生物技术有限公司。实验动物室温度为22-25摄氏度，相对湿度为60％-75％。

1.4 实验菌株 鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA97、TA98、TA100、TA102，由复旦大学公共卫生学院提供

1.5 试验主要仪器及试剂 S-9来源于Molecular Toxicology, Inc.；显微镜、电子分析天平、全自动五分类血细胞分析仪、全自动生化分析仪、l mL注射器等。

2 方法

2.1 安全性试验方法

小鼠急性经口毒性试验 动物禁食（不禁水）16 h后，体重19～22 g的雌、雄小鼠各10 只。采用最大耐受剂量（maximum tolerated dose，MTD）法将受试样品以10.0 g/kg BW剂量对实验动物经口灌胃染毒。染毒后，观察动物的一般状态、体重变化、中毒症状和死亡情况等。实验末再次对动物称重。对死亡动物及到期处死动物进行尸体解剖，肉眼观察大体病理改变情况。

Ames实验 按《保健食品检验与评价技术规范》2003年版，采用标准平板掺入法，选鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA97、TA98、TA100、TA102进行试验。阳性物为2,4,7-三硝基芴铜，甲基磺酸甲酯，2-氨基芴，1,8-二羟基蒽醌(TA102)，同时设阴性对照组(未处理对照组和溶剂对照组)。在加与不加S-9混合液的情况下以5000、1000、200、40和8 µg/皿剂量进行试验，每个剂量组做3个平皿。如果受试样品组的回变菌落数是阴性对照组回变菌落数2倍以上，并具有剂量-反应关系则为阳性。整个试验在相同条件下重复做一次。

小鼠骨髓细胞微核试验小鼠50只，随机分为5个组，每组10只，雌雄各半。设1.05、2.10、4.20 g/kg·bw 3个剂量组、阴性对照组（无菌水）、阳性对照组（环磷酰胺，40 mg/kg·bw腹腔注射）。采用30 h给受试物法。两次给受试样品间隔24 h，第二次给受试样品后6 h处死动物，取胸骨常规制片、镜检，每鼠计数1000个骨髓嗜多染红细胞（PCE），观察含微核的嗜多染红细胞数并计算微核发生率，以千分率计。

大鼠30 d喂养试验 大鼠随机分1.05、2.10、4.20 g/kg·bw 低、中、高剂量组和空白对照组，每组10只，雌、雄各半，连续喂养30 d。每天观察并记录动物的一般表现、行为、中毒症状和死亡情况，实验开始及实验后每周称量1次动物体重，每周2次记录饲料摄入量，计算每周及总的食物利用率。实验期末禁食16 h，眼球取血，断头处死，对每只大鼠进行脏器大体观察，取肝、肾、脾、睾丸称重并计算脏体比，同时进行血象、血生化检查，留取肝、肾、脾、胃、肠、睾丸、卵巢进行病理组织学观察。

2.2数据统计及分析  用SPSS软件进行T检验和卡方检验。

3 试验结果

3.1急性毒性试验结果

在试验期间各组小鼠活动正常，毛色光泽度好，未见任何中毒症状和死亡，到期处死动物，大体解剖肉眼观察各脏器情况，未见异常。雄性小鼠：MTD ＞ 10.0 g/kg BW，雌性小鼠：MTD ＞ 10.0 g/kg BW，见表1。

表1. 雌雄小鼠急性经口毒性试验结果

3.2 Ames试验结果

由表2、表3可见，复方青钱柳铬粉各剂量组回变菌落数均未超过阴性对照组回变菌落数的2倍，亦无剂量-反应关系。即复方青钱柳铬粉对鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102四株试验菌株，在加与不加S-9时，均未见有致基因突变作用。

表2 复方青钱柳铬粉Ames试验回变菌落数(±s)（第一次）

注：**超过阴性对照组菌落数2倍以上

表3  复方青钱柳铬粉Ames试验回变菌落数(±s)（第二次）

注：**超过阴性对照组菌落数2倍以上

3.3 小鼠骨髓细胞微核试验

由表4可见，复方青钱柳铬粉的各剂量组微核率与阴性对照组比较无显著性差异（P > 0.05），而阳性对照组高于阴性对照组，有显著性差异（P < 0.01）。

表4  复方青钱柳铬粉对小鼠骨髓细胞微核发生率的影响

注：** 与阴性对照组比较，P< 0.01。

3.4 30天喂养试验结果

以1.05 g/kg·bw/d、2.10 g/kg·bw/d、4.20 g/kg·bw/d三个剂量给予大鼠30天，受试动物一般情况良好。与对照组相比，雌、雄大鼠各剂量组每周体重、增重、摄食量、食物利用率和总增重、总摄入量、总食物利用率均无统计学差异（P ＞ 0.05）；各实验组大鼠在试验的各项血常规指标及血清生化指标均在正常范围 ,且与对照组值的差异无统计学意义（P ＞ 0.05）；各实验组大鼠脏器重和脏体比与对照组比较, 差异均无统计学意义（P ＞0.05）。对肝脏、肾脏、脾脏、胃、十二指肠、睾丸和卵巢等脏器的组织病理切片检查结果也未见异常。根据卫生部《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）之30天喂养试验，最高给予5.00 g/kg·bw/d的复方青钱柳铬粉，未观察到有害作用。

4讨论与结论

本研究结果显示，复方青钱柳铬粉对雌雄小鼠急性经口的最大耐受剂量（MTD）均大于10.0 g/kg·bw，属实际无毒级。Ames实验、小鼠骨髓细胞微核试验均为阴性结果。经口给予大鼠不同剂量的复方青钱柳铬粉连续30 d, 与空白对照组比较，低、中、高各实验组大鼠无明显差异。结果显示该复方青钱柳铬粉属实际无毒级，安全性较高的一种复配方。

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