ONOO-检测用荧光探针研究进展

ONOO-检测用荧光探针研究进展

王飞,戴志超

临沂大学 山东临沂 276000

摘要：过氧亚硝基(ONOO-)作为一种重要的生物氧化剂，在细胞信号传导、免疫等活动中具有重要的作用。本文介绍了几种用于ONOO-检测的荧光探针，其对于研究ONOO-的生理意义及相关疾病诊断等具有重要意义。

关键词：ONOO-、荧光探针

过氧亚硝基(ONOO-)是一种重要的活性氧/氮物种（ROS/RNS）之一，其在生物系统中是由一氧化氮(NO)和超氧阴离子(O2•-)的反应产生的。它在细胞中信号传导、免疫等生理活动中发挥着重要的作用[1]。然而，ONOO-含量的升高会氧化或分解脂质、蛋白质和核酸，继而导致细胞凋亡和死亡。近年来，越来越多的证据表明，ONOO-含量的异常变化与许多疾病有关，如心血管疾病、神经疾病、炎症、阿尔茨海默病及癌症等[2]。与传统的检测技术相比，荧光传感分析技术具有检测灵敏度高、选择性好及适于原位检测等优点，其在ONOO-的定量检测中有了广泛的应用。本文介绍了几种用于ONOO-检测的荧光探针。

Zhang等人基于钌（Ru）配合物与花菁染料Cy5间的荧光共振能量传递机理，研制了一种用于ONOO-检测的比率荧光探针[3]。探针中能量供体与受体间有较好的光谱重叠，因此具有较高的能量传递效率。当探针与ONOO-反应后，Cy5被氧化后其结构被破坏，导致钌配合物与Cy5间的能量传递效率显著降低，表现为探针在660 nm处的荧光强度逐渐降低，610 nm处的荧光强度逐渐升高，因此能够用两处荧光强度的比值变化，实现对ONOO-的比率检测。该探针对ONOO-具有较高的响应特异性和敏感性，其被成功用于了活细胞线粒体中ONOO-的比率传感和成像研究。

Li等人以罗丹明为发光基团，苯肼为识别基团，三苯基膦为线粒体靶向基团，研制了一种用于ONOO-检测的线粒体靶向荧光探针[4]。探针本身只能发出微弱的荧光，但是当其与ONOO-反应后，探针中的识别基团苯肼被ONOO-氧化而离去，导致罗丹明开环，使得探针在578 nm处的荧光强度显著增强。研究结果表明，该探针具有灵敏高、选择性好等优点。通过共定位实验证实了该探针对线粒体的靶向性。此外，作者将探针成功用于了RAW264.7细胞中ONOO-的成像检测，结果表明细胞在LPS和IFN-γ刺激15 h后，细胞的ONOO-增加了约9倍。因此，该探针在细胞中ONOO-的检测中具有较好的应用前景。

Wu等人以铱(Ir)配合物为发光基团，设计合成了一种用于细胞线粒体中ONOO-/GSH检测的可逆荧光探针[5]。结果表明，该探针具有较高的荧光量子产率、较快的反应速率、高的选择性和近红外发光性能(最大发射波长约为704 nm)，因此在活体ONOO-/GSH的检测中更具优势。该探针被成功用于了细胞中药物刺激下ONOO-/GSH含量的变化监测。

近红外荧光探针具有较好的组织穿透能力及较低的荧光信号干扰，因此在复杂生物样品目标组分的检测中具有更大的优势。Jia等人研制了一种新型的用于ONOO-检测的含硼酸二氰异氟硼酸盐近红外荧光探针[6]。与目前报道的ONOO-荧光探针相比，该探针具有较好的近红外发光性能（最大发射波长为660 nm）和较大的Stokes位移(150 nm)，其对ONOO-检测具有高的特异性、超高的灵敏度(5 nM)及快的响应速度(3 秒)，因此该探针在ONOO-的高灵敏检测中具有较好的应用前景。此外，该探针被成功用于了RAW 264.7细胞中和斑马鱼体内ONOO-的荧光成像检测。

Zhang等人制备了一种用于ONOO-检测的纳米脂质体包裹的比率荧光探针[7]。该纳米探针呈现规则的球形，粒径约为50 nm，其在700 nm处有较强的荧光发射峰。当其与ONOO-反应后，纳米脂质体内的π-偶联体系被氧化水解，使得探针在700 nm处的荧光强度显著下降，而在462 nm处的荧光强度显著增强，因此可以用462 nm与700 nm处荧光强度的比值，实现对ONOO-的比率检测，反应前后其荧光强度比值增加近千倍，且具有较好的特异性。此外，作者通过高斯09程序进行了DFT计算，获得了Cy-O的化学结构光学性质。该纳米探针被成功用于了HepG 2细胞和小鼠中外源性和内源性ONOO-荧光成像测定。

双光子激发荧光探针能够实现活体生物样本的三维荧光成像，具有对生物样本的光损伤弱、组织穿透深度深、背景荧光低的特点。Cheng等人基于荧光共振能量传递机理，首次研制了一种用于ONOO-检测的双光子比率荧光探针[8]。该探针在651 nm处具有较强的荧光，在473 nm处呈现了较弱的发射峰，当其与ONOO-反应后，探针在651 nm处的荧光强度显著降低，而在473 nm处的荧光强度逐渐增强，反应前后探针在473 nm与651 nm处的荧光强度的比值增强约93倍，其对ONOO

-的检测限达11.30 nM，且具有较快的反应速度(20 s内)和较高的选择性。该探针成功应用于了HepG2、RAW264.7细胞内源性ONOO-的比率荧光检测及炎症小鼠模型中ONOO-的荧光成像。

Deng等人以硼酸为识别基团，设计并合成了一种用于ONOO-检测的近红外荧光探针[9]。探针的最大吸收峰为568 nm，其在635 nm处只能发出微弱的荧光（荧光量子产率< 0.01），当其与ONOO-反应后，探针溶液颜色由蓝色变为黄色，其在568 nm处的吸收峰显著下降。而在416 nm处的吸收峰逐渐增强。与此同时，探针在635 nm处的荧光强度显著增强（约288倍），其对ONOO-的检测限为1.69 nM。该探针被成功用于了Hela细胞、斑马鱼及小鼠肝脏中ONOO-的荧光成像测定。

荧光探针作为一种潜在的生物学检测工具，研制更多具有良好应用价值的ONOO-探针，对于研究ONOO-在不同生理和病理环境下的作用具有十分重要的意义。

参考文献：

[1] C. C. Winterbourn. Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species. Nat. Chem. Biol., 2008, 4, 278-286.

[2] X. L. Qin, F. Li, Y. F. Zhang, et al. In Vivo Photoacoustic Detection and Imaging of Peroxynitrite. Anal. Chem. 2018, 90, 9381-9385.

[3] W. Z. Zhang, Y. Liu, Q. K. Gao, et al. A ruthenium(II) complex-cyanine energy transfer scaffold based luminescence probe for ratiometric detection and imaging of mitochondrial peroxynitrite. Chem. Commun., 2018, 54, 13698-13701.

[4] H. Y. Li, X. H. Li, X. F. Wu, et al. Observation of the Generation of ONOO- in Mitochondria under Various Stimuli with a Sensitive Fluorescence Probe. Anal. Chem. 2017, 89, 5519-5525.

[5] W. J. Wu, X. X. Liao, Y. Chen, et al. Mitochondria-Targeting and Reversible Near-Infrared Emissive Iridium(III) Probe for in vivo ONOO-/GSH Redox Cycles Monitoring. Anal. Chem. 2021, 93, 8062-8070.

[6] P. Jia, D. M. Liu, Z. H. Zhuang, et al. Dicyanoisophorone-Derived Near-Infrared Fluorescent Probe for Ultrasensitive Detection of Peroxynitrite in Living Cells and Zebrafish. Ind. Eng. Chem. Res. 2019, 58, 19778-19784.

[7] J. Zhang, J. F. Kai, Y. Y. Sun, et al. Nanoliposomal Ratiometric Fluorescent Probe toward ONOO- Flux. ACS Appl. Bio Mater. 2021, 4, 2080-2088.

[8] D. Cheng, Y. Pan, L. Wang, et al. Selective Visualization of the Endogenous Peroxynitrite in an Inflamed Mouse Model by a Mitochondria-Targetable Two-Photon Ratiometric Fluorescent Probe. J. Am. Chem. Soc. 2017, 139, 285-292.

[9] Y. Z. Deng, G. Q. Feng. Visualization of ONOO- and Viscosity in Drug-Induced Hepatotoxicity with Different Fluorescence Signals by a Sensitive Fluorescent Probe. Anal. Chem. 2020, 92, 14667-14675.

基金项目：临沂大学大学生创新创业训练计划项目资助(S202110452079)。

作者简介：王飞(2000-)，男，汉族，山东日照人，本科生，临沂大学化学化工学院应用化学专业，研究方向：荧光探针的合成与应用。