蛋白质组学技术及其在乳及乳制品中的应用研究进展

蛋白质组学技术及其在乳及乳制品中的应用研究进展

 ,郭东升,郑倩茹

杭州海润泰合检测技术有限公司，310000，浙江省杭州市

摘要：蛋白质组学技术是近年来生命科学研究的重要工具，在食品，医学及动植物研究领域具有独特优势.利用蛋白质组学技术研究乳及乳制品，深入阐明其中蛋白质的表达及动态变化已成为当前的研究热点。本文主要论述蛋白质组学的定义及蛋白质组学及其研究过程中的主要技术，进而提出在乳及乳制品中的应用研究。

关键词：蛋白质组学；乳；乳制品；应用

引言：蛋白质组学工具可用于考察蛋白质的多样性.随着越来越多的细菌基因组网络资源的日益丰富，可以利用蛋白质组学技术来筛选各种发酵食品中的微生物所表达的蛋白质，提供全面而动态的研究。

1.蛋白质组学的定义

在经过全世界科学家的共同努力下，人类基因组计划终于在2005年完成，同时还完成了十余种模式生物的全基因组序列的测定工作。随着人类基因组计划的完成，科学家又进一步提出了后基因组计划即基因功能研究，而蛋白质组学研究就是后基因组计划中的一个重要组成。研究表明，人类一共有24000个基因，但是蛋白质的种类却多达50000种，这就说明由基因控制的蛋白质的表达并不是一一对应的，并且生命体的生命活动的完成是由大量蛋白质相互作用共同完成的，这就给人们研究蛋白质的功能带来了巨大的困难。事实上，人类基因组编码的蛋白质的功能有约一半是未知的，由此而知，对于基因功能的研究将是人们关注的重点。

2.蛋白质组学及其研究过程中的主要技术

2.1 蛋白质的鉴定技术

质谱（mass spectrum，MS）技术是目前最为常用的蛋白质鉴定技术，通过分析经特异性蛋白酶（如胰酶）水解后得到的肽段混合物，能够快速鉴定蛋白质组分，并准确测定肽和蛋白质的相对分子质量、氨基酸序列和翻译后的修饰物。因色谱与质谱的高效性与准确性，两者联用已成为蛋白质组学研究的重要手段。在蛋白质组学中，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight- mass spectrometry, MALDI-TOF-MS）和电喷雾离子化质谱（electrospray ionization-mass spectrometry, ESI-MS）是使用频率较高的质谱。其中，MALDI-TOF-MS常与2-DE技术联用。乌日娜等采用这种技术探究了植物乳杆菌（L.plantarumFS5-5）在盐胁迫下的蛋白质组学变化。而ESI-MS常与HPLC技术联用。PETRELLA等通过两者联用获得了有关意大利水牛干酪中蛋白质水解的信息。

以质谱技术为基础的蛋白质分析目前主要依靠非标记（label-free）技术与同位素标记相对和绝对定量(isobaric tagging for multiplexed relative and absolute protein quantitation, iTRAQ)、多肽体外标记定量(tandem mass tag，TMT)、细胞培养条件下稳定同位素标记（stable isotope labeling with amino acids in cell culture, SILAC）等体内外标记技术。Label free可分析大量蛋白质质谱数据，操作简便，多用于微生态中宏蛋白质组学研究。这些定量技术主要采取数据依赖采集模式(data dependent acquisition,DDA)，随着动态范围更广、准确度更高的数据非依赖采集模式（data independent acquisition,DIA）的发展与成熟，蛋白质的定量与定性将达到前所未有的深度。

2.2生物信息学分析技术

蛋白质组学的数据庞大、关系复杂，其鉴定与分析在很大程度上取决于生物信息学（bioinformatics）技术，需要依靠计算机网络、数据库和应用软件来进行蛋白质序列的比较分析、蛋白质结构与功能预测及蛋白质－蛋白质之间的相互作用与作用途径分析。其中包括对生物信息的收集、加工、存储、检索与分析，获得生物信息后不仅要与数据库中已有信息进行比对，还要通过数据分析对未知功能进行预测。因此，能够自动化处理大规模数据的工具与信息全面准确的数据库是蛋白质组学发展的必然要求。目前已有大量的分析搜索软件和数据库相继出现，可根据不同研究需要进行选择。常见的蛋白质定性软件有MASCOT、SEQUEST、X!Tandem等；数据库可分为蛋白质序列数据库，如SWISS-PROT、PIR等；蛋白质结构数据库，如PDB、SCOP、CATH等；蛋白质功能数据库，如GO、GOG、KEGG等；另外有UniProt、NCBI、EBI等综合性数据库，覆盖了蛋白质的相关数据。

3.蛋白质组学技术在研究乳及乳制品中的应用

3.1利用蛋白质组学技术研究不同加工方式下的乳及乳制品

蛋白质组学技术同样运用于乳品加工条件的探索。臧长江等研究发现75 ℃/5 s热处理对生鲜牛乳中的蛋白质组分及含量无明显影响，而135 ℃/4 s和145 ℃/4 s可造成乳中蛋白质含量的降低。乳清蛋白尤其是免疫球蛋白的热稳定性相对较差，这与刘翠等[47]对山羊乳研究的结果相似。刘鸣畅等研究不同热加工条件对牛乳主要蛋白质成分与含量的影响，结果表明，随着加热强度增加，蛋白质着色点变浅，鲜乳、巴氏乳蛋白点光密度值明显高于超高温瞬时灭菌乳和复原乳，对这些蛋白点进行质谱分析，鉴定出α-S1酪蛋白、α-S2酪蛋白、β－酪蛋白、β－乳球蛋白、κ－酪蛋白、乳糖脱氢酶A蛋白。另外，复原乳在不同热处理条件下，随着温度升高，蛋白着色点变浅，蛋白点出现模糊、拖带现象，部分蛋白异构体增多。FELFOUL等对热处理下骆驼乳与奶牛乳进行蛋白组学分析，结果表明在80 ℃下加热60 min后，骆驼乳和牛乳酪蛋白组分保持完整，而乳清蛋白受到较大影响。骆驼乳中α－乳清蛋白和肽聚糖识别蛋白未能被检出，血清白蛋白含量则显著减少。而牛乳中未检测到α－乳清蛋白和β－乳球蛋白。CHEN等通过LC/MS研究山羊乳蛋白的热依赖性变化，对高温短时、超巴氏杀菌、超高温和低温长时间加热处理的山羊乳进行蛋白质组学分析。所有样品中共鉴定出843种蛋白质，在对照组和加热组中分别定量了527、543、537、533和539种蛋白质，其中共同蛋白质438种。该团队也采用同样的技术手段研究了山羊奶在均质化过程中蛋白质的变化。对照组和均质化组分别量化了310、315种蛋白质，其中16种蛋白质在两组之间有显著差异。在均质化处理组中发现与山羊乳糖酵解/糖异生代谢相关的蛋白质发生了显著变化。这些发现为热处理和均质羊乳的蛋白质特征提供了最新信息。

不同加工条件下乳蛋白质研究中以加热条件为主，采用色谱与质谱联用，旨在探究生产过程中合适的加工参数，以减少加工过程中蛋白质的损失，提高乳制品的营养价值。尽管存在畜种差异，但热加工对乳清蛋白均造成了不同程度的影响。

3.2利用蛋白质组学技术研究发酵乳制品

干酪是牛乳经凝乳并排出部分乳清而制成的新鲜或发酵成熟的产品，富含多种营养成分，并可有效缓解乳糖不耐症。干酪作为发达国家的膳食主体，占其全部乳品消耗量的60%，国外对干酪已有了较为深入的研究。JARDIN等分别选取2种干酪成熟期间3个时间点的水溶性提取物中蛋白质进行研究，鉴定了多种来自牛乳与细菌的蛋白质。结果显示，2种干酪既拥有部分共同的牛乳蛋白质，也存在部分相同的细菌蛋白质。成熟期间细菌蛋白质的浓度从成熟的第7天至第69天增加2.5～20倍。PETRELLA等利用蛋白质组学方法研究河水牛mozzarella干酪中蛋白质水解，对60个市面mozzarella干酪和10个标准mozzarella干酪进行分析，结果显示市面干酪中大部分酪蛋白含量偏多，表明在储存过程中纤溶酶引起了剧烈的蛋白质水解，或是由于使用劣质半成品进行干酪制作所致。PAPPA等分析了由绵羊乳、山羊乳和牛乳制备的成熟120 d后的Teleme干酪水溶性提取物中的组成肽和蛋白质，结果表明，绵羊乳干酪和山羊乳干酪的水溶性提取物中蛋白浓度没有显著差异，且均高于牛乳干酪，而绵羊乳干酪水溶性提取物相比山羊乳和牛乳干酪，能提供更广谱的肽。

IZOUIERDO-GONZALEZ等对山羊乳开菲尔酸乳制品3个发酵时间点的蛋白质消化与生物活性肽进行了研究，以探究发酵过程中蛋白质的消化模式，最后在对应的22个注释蛋白质下鉴定出2 328个特异性肽，并在发酵24 h时发现了肽的最高浓度，鉴定出了11个属于酪蛋白的生物活性肽。

结束语：随着研究深入，发酵或保藏期间乳及乳制品受微生物影响，特别是其中蛋白质的变化已逐渐成为目前研究的难点与重点。探索新的蛋白质分离技术，揭示乳体系与微生物之间关系，蛋白组学将成为有力的工具。另外，蛋白质组学与基因组学、转录组学、代谢组学的联合分析将对揭示微生物与乳环境之间的关系起到重要作用，多组学联合技术将在工业生产领域发挥其独特的优势。

参考文献：

[1]于文皓,祁艳霞,靳艳.蛋白质组学在人乳蛋白质研究中的应用[J].色谱,2019,37(05):471-476.

[2]刘小莉, 董明盛. 蛋白质组学在乳及乳制品特性研究中的应用[J]. 中国乳品工业, 2005, 33(11):4.