空气杀菌清新剂研究

空气杀菌清新剂研究

辜维顗

南京劼美克生物科技有限公司，中国台湾，210036

摘要:研制一种新型紫苏精油型空气杀菌清新剂。利用水蒸气蒸馏法提取紫苏精油，为提高紫苏精油提取率，考察影响精油提取率的单因素以及设计正交试验，确定提取最佳工艺。滤纸片法和试管平板法探究紫苏精油型空气杀菌清新剂对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球三种菌的抑菌活性。结果表明，提取最佳工艺组合为料液比1:15，浸泡时间3h，提取时间4h，紫苏精油型空气杀菌清新剂对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌抑菌效果最强，最低抑菌浓度为12.5μL/mL，金黄色葡萄球菌稍微次之，最低抑菌浓度为25μL/mL。紫苏精油型空气杀菌清新剂是具有显著的抑菌作用，是一种有效的空气杀菌清新剂。

关键词：空气杀菌清新剂；水蒸气蒸馏法；正交试验；抑菌浓度

引言

空气质量问题一直是全世界重点关注对象，随着近年来空气品质的逐步下降，空气当中不仅滋生危害人体生命安全的微生物，并且还充当着重要的传播介质，更是当下疫情严重，反复发作。当下追求清新、干净空气成为了极大的需求，因此空气杀菌清新剂是净化空气、预防疾病、控制疫情传播途径的重要措施。目前我国市场上出现的空气清新剂按成分区分由化工原料制剂、植物制剂两种组成。化工原料制剂是一种通过化学物质合成的化学制剂，在使用过程中空气清新剂汽化的过程当中会产生一种称做气溶胶的有害物质，散发浓烈的刺鼻味道，不仅杀菌不彻底，反而对环境有着一定的污染；植物制剂是由植物精油作用空气清新，所研制的空气清新剂也有着明显的抑菌效果。植物制剂相对于化工原料制剂有着无污染、无毒净化、清新空气等优点。

为研制具有清新空气和抗抑菌性强而气味芳香的植物精油型空气杀菌清新剂，采用药食两用性紫苏为研究对象，因此以紫苏叶为原材料进行精油的蒸馏提取、工艺优化，通过GC-MS法鉴定深入了解紫苏精油的化学成分及属性，制备紫苏精油型杀菌空气清新剂并结合抑菌活性等研究评估其活性的强弱，探讨其抑菌效果。为以后开发紫苏精油提供相关理论依据。

1紫苏精油的提取

1.1实验材料

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis），大肠杆菌（Escherichia coll），金黄色葡萄杆菌（Staphylococcus aureus Rosenbach）均由河南省工业微生物菌种工程技术研究中心提供，-80℃低温冰箱冻存，试验前复苏传代使用；供试紫苏于2020年8月28日采自贵州省贵阳市花溪区天河潭实验基地。新鲜紫苏叶置于阴凉处晾干后粉碎过80目筛备用。

1.2精油提取方法

1.2.1紫苏精油提取率的测定

精油提取率见下公式计算：

精油提取率（%）=精油质量（g）/紫苏叶干重(g)×100

1.2.2紫苏精油提取方法

本实验采用水蒸气蒸馏法(SD)法提取，称取前期处理的紫苏叶粉末50g倒入2000mL烧瓶中，按相应料液比加入蒸馏水进行提取，设置提取时间，蒸馏温度100°C（提取时间以沸腾开始计时）。

1.2.3水蒸气蒸馏法提取紫苏精油工艺优化

(1)单因素试验

表1.1单因素实验选取的数据

(2)正交试验优化

在单因素实验基础上，设计3因素3水平L9(33)正交试验

表1.2正交实验选取的数据

1.3紫苏精油GC／MS分析

紫苏精油用正己烷稀释，取1μL溶液进样，采用GC-MS对试样的化学组成进行分析。GC分析条件：HP-5MS弹性石英毛细管柱（30m×0.25μm×250μm）；FID检测器；柱温40℃（保持2min），以4℃/min的速率升至206℃，再以10℃/min的速率升至310℃，运行62min；汽化室温度250℃；氦气（99.999%）为载气，流速1mL/min，20:1的进样分流比，溶剂滞后6.0min。MS分析条件：电子能量70eV，EI离子源，温度230℃；四极杆温度150℃，发射电流34.6μA，倍增器电压1482Ｖ，质量范围40~500amu。各峰与标准图谱库Nist17和Wiley275比对，确定精油的化学组成，用峰面积归一化法计算各化学组成的相对含量。

1.4空气清新剂的研制

按SD法提取紫苏精油，经紫苏精油与紫苏纯露混合以1:9的比例制成空气清新剂并灌装于瓶中制成紫苏精油型空气杀菌清新剂。

1.5抑菌效果的评定

1.5.1滤纸片法

用打孔器打出半径为3mm的滤纸片，经过高压蒸气灭菌后放在干燥箱60℃条件下烘干取出紫外灭菌半小时，备用。实验前在超净工作台上将其一部分放入紫苏精油型空气杀菌清新剂中充分浸泡半小时，另一部分放入无菌水中充分浸泡相同时间设置为空白对照。将不同菌种的培养物均稀释到原浓度的10-4各取100μL稀释液均匀涂布至直径为85mm的营养琼脂培养基中，再将充分浸泡清新剂的滤纸片（3片）、空白滤纸片（1片）分别贴在平板上，保持一定距离，在37℃恒温培养箱中培养24h，测定抑菌圈的直径，重复三次实验。抑菌圈试验判定标准见表1.3。

表1.3抑菌圈评判标准

1.5.2试管平板法

用营养肉汤液体培养基对将紫苏精油型空气杀菌清新剂进行倍比稀释，取六支无菌试管，分别将浓度稀释为50μL/mL、25μL/mL、12.5μL/mL、6.25μL/mL、3.125μL/mL、1.5625μL/mL，使得体积为2mL，每只试管加入106cfu/mL菌液0.1mL，于37℃恒温培养箱中培养24h后取试管中菌液10μL均匀涂到平板上，同等条件下再次培养24h观察细菌的生长情况。不长菌的即为最低抑菌浓度（MIC)。

1.6数据处理与分析

表1.3数据处理参用软件

2结果与分析

2.1水蒸气蒸馏法提取紫苏精油工艺优化

2.1.1料液比对精油提取率的影响

如图2.1所示，前期液料比与紫苏精油的提取率呈正相关，可能是料液比变大，物料与水接触更加充分，更利于精油提取。当料液比为1:15时提取率为最大值。后期水蒸气变多，未得到完全冷却，一部分精油随着水蒸气挥发。使得精油提取率下降。当冷凝效果一定的情况下，选择合适的液料比才能精油的提取效果得到最大化，考虑到实验综合因素，选择液料比为1:15较为合理。

图2.1料液比对精油提取率影响

2.1.2浸泡时间对精油提取率的影响

如图2.2所示，浸泡时间变长，精油的提取率先增后减。有可能因为水散作用将精油逐步扩散至组织表面，利于精油的提取。到达最大值时精油提取效率反而降低，这可能是因为精油挥发性大，导致一部分精油的挥发损失。即当浸泡时间为3h时，紫苏精油提取率最高。

图2.2浸泡时间对精油提取率影响

2.1.3提取时间对精油提取率的影响

如图2.3所示，随着蒸馏时间增长，提取率先缓慢上升后急速下降。这是因为提取精油会随着提取时间的延长而提取量增大，直到组织内外精油浓度达到平衡为止。但在蒸馏后期，精油的有效成分会随着蒸汽的缘故而减弱。综合考虑提取设备条件，选择提取时间为3h时，既保证了精油得率又节约能耗和时间。

图2.3提取时间对精油提取率的影响

2.1.4正交试验结果及工艺优化

正交试验结果及方差分析结果表明，紫苏精油提取实验的3因素中，其影响大小为：A>C＞B，即料液比>提取时间＞浸泡时间。料液比达到极显著水平(P<0.01)，其次提取时间、浸泡时间均达到显著水平(P<0.05)。较佳工艺组合为A2B1C3，即料液比1:15，浸泡时间2h，提取时间4h。进行三次平行实验，紫苏精油提取率可达到0.97%。

2.2紫苏精油GC／MS分析

2.2.1GC／MS图谱

图2.4GC-MS图谱总离子流图

由图2.4得知紫苏叶香气成分的气相色谱离子流图在30min到52min时间段里大量出峰，在保留时间17.5min、22min、58min左右也有少量峰值出现。

2.2.2紫苏精油GC／MS分离鉴定出的挥发性成分

SD法提取精油所检出成分共39种，相似度均达到90%以上，其中检出率为94.395%。主要是以萜烯类化合物为主，其中含量最高的化合物为methyl benzoate（苯甲酸甲酯）34.865%，其他含量较高的还有alpha.-Bergamotene（反式α-贝加莫泰内）6.081%，caryophyllene oxide（石竹烯氧化物）7.276%，(+) spathulenol（匙叶桉叶油醇）6.53%，bate.-caryophyllene（β-石竹烯）8.302%，Perillyl alcohol（紫苏醇）2.6085%，Phytol(叶绿醇)2.749%，等其他化合物。很少在紫苏精油相关文献检测出或描述苯甲酸甲酯，本身具有强烈的花香和果香，有依兰和晚香玉似的香韵，并有酚的气息，其紫苏相关品种以及苯甲酸甲酯抑菌性有待进一步研究。

2.3空气杀菌清新剂的研制

为了极大程度上保留紫苏精油原有活性，具体操作如下：将紫苏精油逐渐加入至紫苏纯露（紫苏精油在蒸馏萃取过程中留下的冷凝水溶液），搅拌1小时，装瓶制成喷雾剂，使得喷雾含紫苏精油达到0.1mL浓度，喷出雾化颗粒小于10μm。（使用前请上下振荡）

2.4抑菌效果的评定

2.4.1抑菌圈测定

紫苏精油型空气杀菌清新剂对三种供试菌种的抑菌圈直径见表2.1。图2.5、图2.6和图2.7分别显示了紫苏精油型空气杀菌清新剂对三种供试菌种的抑制作用的代表性图片。结果表明，紫苏精油型空气杀菌清新剂对供试菌种呈现出一定的抑菌效果。对枯草芽孢杆菌22.33±1.15mm为高敏感，大肠杆菌的抑菌圈直径为18.67±1.76mm为高敏感，金黄色葡萄球菌14.22±0.96mm中敏感。紫苏精油型空气杀菌清新剂对枯草芽孢杆菌的抑菌活性最强，其次是大肠杆菌，最后是金黄色葡萄球菌。紫苏精油型空气杀菌清新剂对三种菌都存在显著性差异。

表2.1紫苏叶精油对各供试菌的抑菌圈直径(mm)

注：①同一行不同字母表示紫苏精油对供试菌的抑菌圈直径间存在显著性差异(p<0.05，n=3)，②滤纸片直径（6mm）包含在测量结果中

图2.5（E.coli抑菌圈）              图2.6（S.aureus抑菌圈）

图2.7（B.subtilis抑菌圈）

2.4.2最小抑菌浓度测定

从表2.4中看出，紫苏精油型空气杀菌清新剂对于枯草芽孢杆菌与大肠杆菌的抗性较强，当达到时浓度12.5μL/mL已没有菌落被检测来，当在试管当中培养时，浓度为6.25μL/mL时大肠杆菌比枯草芽孢杆菌较为浑浊，对枯草芽孢杆菌的抑菌效果最好，这也在抑菌圈测定时得到验证，对金黄色葡萄球菌抑菌活性最弱，最低抑菌浓度为25μL/mL。三种菌的空白对照都未观察到有抑菌圈的出现。

表2.2不同浓度的杀菌清新剂供试菌的MIC

注:一表示无菌生长，+表示少量菌生长，++表示大量菌生长

3讨论与结论

3.1讨论

在紫苏精油提取方面，本实验使用SD法提取精油，要使其提取精油得率达到最大值，首先确定单因素，通过正交试验验证，获得最佳工艺。紫苏有效成分的检测由于实验设施问题，送检至贵阳市白云区高海路3491号贵州城内重点实验室，对其采用GC-MS对试样的化学组成进行分析,检测出紫苏醛和亚麻酸等常规指标，其中紫苏醛、芳樟醇、石竹烯是精油香气的主要来源以及拥有良好的抑菌活性。也包含有橙花醇、肉豆蔻酸等紫苏精油少见的化学成分。本实验对紫苏精油型空气杀菌清新剂的制作是参考吴慧清等研制空气清新剂制作，但因为其加入乙醇作为乳化剂，本着不加入任何化学试剂的理念，将乙醇替换成紫苏纯露，紫苏纯露本身就在提取过程当中精油部分有效成分融入当中，有着一定的抑菌性，这和紫苏精油对抑菌有着一定的协同性。在抑菌过程当中由于操作的不当多次造成实验材料浪费与结果有着相对偏差等后果。希望相关问题能得到一定改善。

就目前国内外对紫苏精油的研究近况来看，精油提取率低下，挥发性强、见光易分解、容易被空气当中空气氧化，精油不可控制的重量损失和挥发速率只能使精油发挥短期效应，这些紫苏精油的短板很难让紫苏在食品，医学等行业当中有着相关发展。紫苏在我国各个省份均有种植，且廉价易存活，紫苏精油香气扑鼻，对人体无害有着一定的抑菌效果。作为化妆品天然香料来源有着极高的研究价值。

3.2结论

通过本实验初步研究，确定使用SD法提取紫苏精油的最佳工艺为料液比1:15，浸泡时间2h，提取时间4h。送检检测成分当中含有Perillyl alcohol（紫苏醇）、9,12,15-Octadecatrienoic acid，methyl ester（亚麻酸)、 Linoleic(亚麻油酸）等常见的化学成分，但含量最高的却是methyl benzoate（苯甲酸甲酯），含量高达34.865%，在类似研究报告当中还未大量检测到，其相关理化性质有待进一步研究。紫苏精油型空气杀菌清新剂对三种供试菌种的抑菌圈和MIC的测定，结果表明均有一定的抑制或杀菌作用。对枯草芽孢杆菌的抑菌活性最强，其次是大肠杆菌，最后是金黄色葡萄球菌。枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的最低抑菌浓度为12.5μL/mL，金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为25μL/mL。紫苏作为药食两用性植物，其独有的芳香深受大众喜爱。综合本实验研究由其制成的紫苏精油型空气杀菌清新剂对细菌具有较强的抑制效果，紫苏精油可以用于制备清新空气、抑制杀菌的清新剂。

参考文献：

[1]李珊珊,郑开斌等.漳州地区产紫苏叶挥发油成分GC-MS分析[J].中药材,2018,41(07):1633-1636.

[2]况弯弯.紫苏挥发油微囊的制备与表征、抑菌活性研究[D].江西中医药大学,2020.

[3]王琴琴.紫苏精油提取及微囊化技术研究[D].中北大学,2020.

[4]吴慧清,吴清平,石立三等.植物精油型空气杀菌清新剂的研制及效果评价[J].食品科学,2008,29(11):161-164.

作者简介：辜维顗（1974.7——），男，中国台湾人，硕士研究生，研究方向：生物科技