4种β-受体激动剂检测方法的建立

4种β-受体激动剂检测方法的建立

杨丽媛

(七台河市疾病预防控制中心，黑龙江省七台河市 154600)

摘要：β-受体激动剂是与肾上腺素、苯乙醇胺类在化学结构、生理特性相似的一种化学合成物质，此种药物具有增加胴体瘦肉率，降低脂肪含量，增快禽畜生长的作用，这类药物被统称为“瘦肉精”，被广泛应用的3种典型“瘦肉精”分别是克伦特罗（KLTL）、特布他林（TBTL）、沙丁胺醇（SDAC）及莱克多巴胺（LKDBA）。

关键词：受体激动剂、苯乙醇胺类物质、液相色谱、检测

前言

β－受体激动剂，是一类人工合成的苯乙醇胺类物质，包括克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、特布他林、异丙喘宁、氯丙那林、西马特罗、非诺特罗等。该类药物在动物性食品中的残留会对消费者身体造成不同程度的影响，对于易感人群危害更为严重[1]。

2002年，β－受体激动剂被列入《食用动物禁用兽药及其他化合物清单》。现阶段，对β－受体激动剂的检测方法较多。刘佳等建立了一种猪肝中26种β－受体激动剂药物残留的反相液相色谱—串联质谱检测方法，26种β－受体激动剂在5，10，20ug/L添加水平的回收率为64.0%~112.7%，相对标准偏差＜15.2%，方法检出限为0.15~1.35ug/kg[2]。金玉娥等也采用液相色谱—串联质谱测定了猪肉和猪肝中11种β－受体激动剂，采用内标法定量，可以满足食品安全法规的需要。Zhan等、薛良辰等、欧阳珊等、Bodi等、Tang 等、Jelka等分别用液相—质谱、质谱测定了β－受体激动剂药物残留的含量，都取得了比较理想的结果[3]。但上述研究的前处理过程都比较复杂，比较费时费力。生物样品基质复杂，内源性物质会干扰检测结果。液相串联质谱联用法特异性强、灵敏度高，是现阶段最主要的检测技术手段，本试验拟建立同时检测牛肉、羊肉、牛肝中β－受体激动剂的超高效液相串联质谱联用的分析方法，以期为快速检测和监管食源性瘦肉精残留提供技术保障，为动物源食品中兽药残留高通量快速分析检测提供技术参考。

我国食品安全监管工作不容懈怠，加强食品安全监管，按照要求落实“瘦肉精”的安全监管，提高“瘦肉精”的检测水平和效率，有效开展食品安全监管工作，保障人们的身体健康。希望通过对“瘦肉精”相关理论的研究，能够深刻认识到“瘦肉精”检测工作的重要性，促进食品检测技术的发展进步。

1材料与试剂

1.1实验材料

本实验实验材料为50份随机抽取五个地市区县市场售卖的羊肉卷、牛肉及牛肝各1000g。实验材料详情见表1。

表1实验材料详情

1.2药品与试剂

药品与试剂主要有：正己烷、氨水、甲酸、甲醇、乙酸乙酯、乙酸铵、β-葡萄糖苷酶、克伦特罗标准品(KLTL)、沙丁胺醇标准品(SDAC)、莱克多巴胺标准品(LKDBA)、特布他林标准品(TBTL)、D6-莱克多巴胺标准品(LKDBA-D6)、D3-沙丁胺醇标准品(SDAC-D3)、D9-克伦特罗标准品(KLTL-D9)、PXC固相萃取柱

1.3仪器设备

表2实验仪器与设备

1.4试剂溶液的配制

混合标准储备液（1 ug/mL），分别准确吸取沙丁胺醇、克伦特罗、莱克多巴胺标准品（100ug/mL）1.00 mL，至100 mL的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，于4℃避光储存待用。

缓冲液：用电子天平称取13.6g乙酸铵固体，加5.5mL乙酸，定容至500mL容量瓶，配制成PH5.2的乙酸铵缓冲溶液（0.2M）。

2%甲酸溶液：用1mL移液器，吸取1mL纯甲酸溶液定容至50mL，备用。

10%甲醇溶液：用1mL移液器，吸取5mL纯甲醇溶液用娃哈哈水定容至50mL，备用。

洗脱液：在通风厨内，用量筒分别量取乙酸乙酯、甲醇以及氨水（比例50：45：5）配制成洗脱液，现用现配。

流动相：0.1%甲酸水溶液：取 1.0 mL 甲酸，用水定容至 1000 mL 混匀，过膜后待用；20%甲酸水溶液：取 200mL 甲酸，用水定容至 1000 mL 混匀，过膜后待用。

内标混合应用液（250ng/mL）：准确吸取混合标准储备液（1ug/mL）2.5mL,用甲醇稀释至10mL。

标准曲线的配置：取10 mL1ug/mL混合标准储备溶液于 100mL 容量瓶中, 用甲醇溶解并定容至刻度，得100ug/mL混合标准液，进一步取0.1mL用甲醇稀释至100ng/mLβ-受体激动剂标准待用液。

分别吸取100ng/mLβ-受体激动剂标准待用液50uL、100uL、200uL、500uL、1mL至10mL离心管中，加入0.5mL 50ng/mL内标，配置成0.5ng/ml、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL标准曲线。

2前处理与色谱方法建立

2.1前处理方法建立

2.1.1 试样的制备和保存：样品采集 200-500 g，用均质器绞碎，四分法取 50-100 g，放在具塞塑料瓶（管）中，贴上标签后，称取试样后将剩余试样放在-18℃冰箱冻藏。

2.1.2酶解：称取 1.00g 经均质均匀的动物组织于 50 mL 离心管中,加 20 uL 250ug/Lβ-受体激动剂内标混和应用液静置 10 min，加入 5 mL缓冲液，旋转振荡器震荡10min摇匀，加入20uL β-葡萄糖醛苷酶，旋转振荡器震荡10min摇匀，在 37℃水浴锅中水解 16h后取出冷却至室温，旋转振荡器震荡10min摇匀，用低温高速离心机0℃下 10000 r/min 离心 10 min，分出上层溶液至新离心管中，加入3mL正己烷，旋转振荡器震荡5min摇匀，继续 0℃下 10000 r/min 离心 5min，取下层液体待净化。

2.1.3 净化：依次用3mL 甲醇、3mL 水、3mL2%甲酸水活化平衡 PXC 固相萃取柱，然后取2.5mL上述离心后的下液至柱内，待样品过柱后，加3 mL水、3mL纯甲醇后，放置在具塞试管上，加3mL洗脱液，置于多样品平行蒸发仪中，利用有机试剂沸点进行旋转蒸发至蒸干，加入10%甲醇水1mL，过0.22μm滤膜滤膜过滤至顶空瓶中待分析。

2.2UPLC条件

（a）色谱柱：Thermo柱（2.6um，150*2.1mm）；柱温：30℃。

（b）流动相分别采用 A 为0.1%甲酸水，B 为纯甲醇，C为20%甲醇水，采用的梯度洗脱：0-0.5 min，5%B；0.5-2.0 min，50%B；2.0-3.0 min，95%B；3.0-5.5 min，95%B；5.5-6.0 min，5%B；6.0-8.0 min，5%B。

（c）流速：0.2 mL/min。

（d）进样体积：2 uL。

2.3质谱条件

（a）离子源：电喷雾离子源（ESI）。

（b）毛细管电压：0.5kv；离子源温度：275℃；离子传输管温度：325℃。

（c）扫描方式：克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林、 D6-莱克多巴胺、D3-沙丁胺醇及 D9-克仑特罗均为正离子扫描。

（d）检测方式：多反应检测（MRM）。

（e）雾化气、气帘气、辅助加热气由氮气发生器产生或使用高纯氮气、碰撞气均为高纯氩气；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求。

（f）锥孔电压、碰撞能量等电压值应优化至最优灵敏度。

（g）定性离子对、定量离子对，锥孔电压及碰撞能量见表4。

3结果与讨论

3.1质谱条件的确定

根据这些化合物的化学结构和性质，在正离子扫描模式下，用蠕动泵按照化合物的绝对响应，以一定的速度对标准物质进行流动注射分析，对质谱参数进行优化处理。通过一级质谱全扫描模式分析确定分析物的分子离子，调试选择最佳的毛细管电压和锥孔电压，找到[M+H]+丰度最高的作为母离子，接着对分析物母离子进行二级质谱分析，获取碎片离子信息，优化碰撞能量等相关参数；选择信噪比最强和次强的两个子离子分别作为定量和定性离子，同位素内标物质只需要选择信噪比最强的子离子。最终确定的质谱的多反应监测条件参数见表3。

表 3各化合物质谱参数

注：带*为定量离子

3.2标准曲线和检出限

将各种目标化合物标准工作溶液用甲醇稀释，分别配制成浓度为0.5~10.0ng/mL的系列标准工作曲线，按2.2和2.3中所确定的液相条件和质谱条件进行检测。以目标化合物质量浓度为横坐标，目标化合物的峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，拟合线性曲线，结果见表4。表4结果表明：在质量浓度0.2~20.0ug/L浓度范围内目标化合物均呈良好的线性关系，相关系数R2≥0.9985。对阴性样品进行加标，经前处理后的样液进行检测，根据目标化合物色谱峰信号强度的S/N=3和S/N=1得出样品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林的检出限和定量限分别为0.3ug/kg，0.1ug/kg。

表4标准曲线校准结果

3.3回收率和精密度

以不含目标分析物的阴性样品进行加标回收率和精密度试验。准确称取样品1.0g，设定4个添加水平（检出限、2倍检出限、4倍检出限、10倍检出限），混匀后根据2.1方法进行酶解、净化和测定，每个添加水平平行样品5个，计算添加平均回收率和精密度，其回收率和精密度见表5。由表5可知：样品中各目标化合物的回收率为90.00%~132.06%，精密度为1.7%~5.7%。

表5 回收率和精密度

3.4样品测定结果

克伦特罗检出率最高，阳性检出率达到6%。检出的样品为两份牛肝，一份牛肉。

4结论

采用优化后的超高压液相色谱-串联质谱法测定了牛肉、牛肝以及羊肉卷中 4 种 β-受体激动剂类药物残留的含量，方法操作简捷、准确度高和灵敏度佳，能满足牛肉、牛肝、羊肉卷中 β-受体激动剂类药物残留的检测需要。

参考文献

[1] 刘先军,王一红,李帮锐,等.超高压液相色谱—串联质谱法检测动物组织中26种β－受体激动剂[J].中国食品卫生杂志,2015,27(3),265-270.

[2] 农业部发布食品动物禁用的兽药及其它化合物清单[J].中国兽药杂志,2002,36(4):11-12.

[3] 欧阳姗,庞国芳,谢丽琪,等.动物组织中卡巴氧和喹乙醇以及相关代谢产物的液相色谱—串联质谱检测方法[J].分析测试学报,2008,27(6):590-594.