固相萃取-高效液相色谱法测定饮料和糖果中11种合成色素的方法研究

固相萃取-高效液相色谱法测定饮料和糖果中11种合成色素的方法研究

贺菲

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摘要：目的 建立了食品中固相萃取-高效液相色谱法测定柠檬黄、新红、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、酸性红、喹啉黄和赤藓红11种人工合成色素。方法 样品采用乙醇氨水提取，弱阴离子固相萃取柱净化，经C18反相色谱柱分离，甲醇和 20mmol/L乙酸铵为流动相梯度洗脱，流速 1.0 mL/min。采用二极管阵列检测器，外标法定量。结果 11种人工合成色素在 42分钟内可实现完全有效分离, 在3.6~36 μg/mL 的线性范围内相关系数均0.9997~0.9999, 平均回收率为80%~110%之间，相对标准偏差为 0.3%~3.9%, 新红、胭脂红、日落黄、赤藓红、柠檬黄、喹啉黄检出限为0.5mg/kg，苋菜红、诱惑红、酸性红、靛蓝、亮蓝检出限为0.3mg/kg。结论 该方法前处理简单、检测快速、回收率满意且重复性好，可作为饮料和糖果中11种人工合成色素的检测方法。

关键词：固相萃取；高效液相色谱法；食品；合成色素；测定方法

1引言

合成色素作为食品添加剂广泛应用于饮料、糖果、糕点等多种食品中，以增强食品的视觉吸引力。然而，过量摄入某些合成色素可能对人体健康产生不利影响，因此，建立准确可靠的检测方法对监控食品中合成色素的含量至关重要。本文采用固相萃取-高效液相色谱法，旨在提供一种简便快捷的分析手段，满足食品安全监测的需求。目前常用的检测方法有高效液相色谱技术以其高灵敏、高选择及优异再现性成为主流，能精确测量多种色素至纳克级，但需高端设备、复杂操作及繁琐前处理、TLC-薄层色谱成本效益高，适于基础筛查，操作简易无需精密仪器，然其分辨率与敏感度略逊一筹、ELISA-酶联免疫吸附法凭借特异抗体快速筛选特定色素，灵敏度高，但存在特定性局限及假阳性/假阴性问题、比色与光学法-利用化学反应的颜色变化或光散射进行定性半定量分析，简便快捷，但精度受限，易受外界干扰、极谱法-如示波极谱，通过电位电流特性检测，简便且灵敏，但对样品处理及设备要求较高、分光光度与μV-Vis吸收法-根据色素吸收光谱定性定量，操作简便且设备普及，却易受共存物干扰。

2实验材料与方法

2.1仪器设备及条件

2.1.1实验设备

waters e2695高效液相色谱仪（沃特世科技有限公司）；EOAA-HM-01多管漩涡混合器（上海安谱实验科技股份有限公司）；H1850高速离心机（湘仪离心机有限公司），转速10000r/min；固相萃取装置（Agela）；FE28型pH计（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）； SHA-C水浴恒温振荡器（常州普天仪器制造有限公司）；LN-24氮气浓缩器（济南蓝迈仪器有限公司）；AL204型分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）。

2.1.2高效液相色谱仪分析配置详情

仪器型号：Waters e2695，序列号CQT101（2）色谱柱规格：C18柱，直径4.6mm，长度250mm，粒径5μm

2.1.3实验条件设定

流速：1.0mL/min；进样体积：10μL；柱温：30°C

2.1.4检测设置

检测器类型：二极管阵列，波长覆盖范围400~800nm；特定波长：柠檬黄与喹啉黄415nm；新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、酸性红及赤藓红520nm；靛蓝与亮蓝610nm.

2.1.5流动相组成

A相：20mmol/L乙酸铵溶液

B相：100%甲醇

2.1.6梯度洗脱程序

0~12min:90%A;12-19min:60%A;19-22.5min:50%A;22.5-24min:45%A;24-33min:5%A;33-34min:5%A;34-42min:90%A。

2.2样品、试剂、耗材及标准物质信息

样品选取了市售品牌饮料和糖果。实验所用化学试剂规格如下：色谱级甲醇（CH3OH）、分析纯甲醇(CH3OH)、分析纯石油醚、无水乙醇(C2H6O)、氨水(NH3·H2O)、色谱纯乙酸铵(C2H7O2N)、分析纯甲酸(CH2O2)。

实验耗材则包括WAX型号（150mg，6ml）的弱阴离子交换固相萃取柱；有机滤膜（0.22μm）；塑料离心管（50ml）。

标准物质信息表见表1：

表1标准物质信息表

3样品前处理

3.1试样提取

3.1.1液体样品处理

①称样: 精确量取2克样品（精确至0.001克）。若为冷冻产品，先在温水浴中融化后再进行称重。②提取: 将称好的样品置入50毫升带盖离心管中，加入足量乙醇氨水混合溶液，使用涡旋混合器振荡1分钟，随后以5000转/分钟的速度离心5分钟。③定容: 离心后，用乙醇氨水溶液补足至总体积至50毫升，得到初步提取液。④净化浓缩: 准确移取上层清液10毫升，在50摄氏度下利用氮气浓缩至约3毫升。之后，分两次至三次，每次加入约10毫升5%的甲醇水溶液进行稀释溶解，制得待净化的样品溶液。

3.1.2固体类试样

①称样：准确量取2克样品（精确至0.001克）置入50毫升带盖离心管中。②预处理：首先加入2至5毫升水，于50摄氏度水浴中加热并搅拌均匀样品，随后加入25毫升乙醇氨水溶液。③提取：使用涡旋混合器振荡1分钟，接着在50摄氏度下超声或以≥250转/分钟速率振摇提取20分钟。④离心分离：以8000转/分钟离心5分钟，取上清液放入50毫升容量瓶中。⑤重复提取：向离心管中每次添加约5至10毫升乙醇氨水溶液，重复提取直至上清液无明显颜色变化，每次提取后均进行离心并合并上清液。⑥定容：最后，使用乙醇氨水溶液将合并的上清液定容至50毫升，获得提取液。⑦净化浓缩：从提取液中准确移取10毫升，在50摄氏度下通过氮气浓缩至大约3毫升，然后分两次或三次加入总量10毫升的5%甲醇水溶液溶解，制得净化液以备后续分析。

3.2 试样净化

3.2.1 活化

依次用6mL 甲醇和6mL 水活化固相萃取柱，保持柱体湿润。

3.2.2上样

活化后立即将待净化液以2s~3s1滴的流速加载到固相萃取柱上。

3.2.3 淋洗

依次用6mL2%甲酸水溶液和6mL甲醇淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液，真空抽2min 至柱体近干。

3.2.4 洗脱

用6mL 2%的氨化甲醇溶液洗脱，分两次加入，每次3mL, 流速低于2秒~3秒1滴，收集洗脱液，于50 ℃氮气浓缩至近干，准确加入2mLpH为9.0的乙酸铵缓冲溶液溶解，溶液用针筒过滤器，孔径0.45μm 的滤膜过滤，弃去2滴~5滴初滤液，取续滤液作为待测液。

4标准溶液配制及校准曲线

表 2 标准物质储备液浓度、线性回归方程及线性相关系数

表2.1 康师傅饮料基质标准物质储备液浓度、线性回归方程及线性相关系数

表2.2 糖果基质标准物质储备液浓度、线性回归方程及线性相关系数

4.1标准溶液配制

合成着色剂储备液：精确移取4.50mL 液体标准溶液(详细参数见表1)至10.0mL 容量瓶中，

配制成各个参数的储备液，具体储备液浓度见表2。准确称取11.44mg 靛蓝固体标品于25mL 容量瓶中，用水稀释并定容至刻度，制成浓度为457.6μg/mL 的储备液；准确称取12.44mg 喹啉黄固体标品于25mL 容量瓶中，用水稀释并定容至刻度，制成浓度为497.6μg/mL 的储备液。中间液I:  准确移取各个参数的储备液1.0mL于20.0mL 容量瓶中，用水稀释并定容至刻度， 制成浓度为22.5μg/mL 的中间液I  (靛蓝浓度为22.88μg/mL 的中间液I, 喹啉黄浓度为24.88μg/mL的中间液I)。

4.2校准曲线的绘制

准确移取新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、酸性红和赤藓红储备液各0.5mL 于10mL 容量瓶中，用水稀释并定容至刻度，制成浓度为22.5μg/mL 的7种合成着色剂混合标准溶液。准 确移取0.05mL、0.10mL、0.20mL、0.30mL、0.40mL、0.50mL、0.60mL、0.80mL的混合溶液至5.0mL 容量瓶中，用水稀释并定容至刻度，制备成校正标准工作液，溶液中7种合成着色剂质量浓度分别为0.225μg/mL 、0.450μg/mL 、0.900μg/mL、1.35μg/mL 、1.80μg/mL 、2.25μg/mL 、2.70μg/mL、3.60μg/mL.准确移取柠檬黄、喹啉黄、靛蓝、亮蓝储备液各0.5mL于10mL容量瓶中，用水稀释并定容 至刻度，制成柠檬黄、亮蓝浓度为22.5μg/mL, 喹啉黄浓度为24.88μg/mL、靛蓝浓度为22.88μg/mL的4种合成着色剂混合标准溶液。准确移取0.05mL、0.10mL、0.20mL、0.40mL、0.50mL、0.60mL、 0.70mL 、0.80mL 、1.00mL的混合溶液至5.0mL容量瓶中，用水稀释并定容至刻度，制备成校正标准工作液，溶液柠檬黄、亮蓝质量浓度分别为0.225μg/mL、0.450μg/mL、0.900μg/mL、1.80μg/mL、 2.25μg/mL、2.70μg/mL、3.15μg/mL、3.60μg/mL、4.50μg/mL。喹啉黄质量浓度分别为0.2488μg/mL、 0.4976μg/mL、0.9952μg/mL、1.9904μg/mL、2.4880μg/mL、2.9856μg/mL、3.4832μg/mL、3.9808μg/mL、4.9760μg/mL;靛蓝质量浓度分别为0.2288μg/mL、0.4576μg/mL、0.9152μg/mL、1.8304μg/mL、2.2880μg/mL、2.7456μg/mL 、3.2032μg/mL 、3.6608μg/mL、4.5760μg/mL。以校正标准工作液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作图，同时用最小二乘法进行线性回归， 分别得到液体基质合成着色剂线性回归方程及线性相关系数 R²具体见表2。结果表明，合成着色剂在0.225μg/mL-4.5760μg/mL 范围内，质量浓度与峰面积具有良好的线性；

5结果计算与表示

5.1合成着色剂含量按下面公式(1)计算：

  （1）

式中：X 表示试样中合成着色剂的含量，单位为克每千克（g/kg）；c 是通过标准工作曲线确定的试样溶液中合成着色剂的质量浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；V1是样品经过净化并最终定容的体积，单位为毫升（mL）；V2是用于提取样品的溶液体积，单位为毫升（mL）；V3是从提取液中用于净化分取的体积，单位为毫升（mL）；m 是试样的取样重量，单位为克（g）；10001000 为将毫克转换为克的换算系数。

5.2回收率按下面公式(2)计算：

(2-1)

(2-2)

(2-3)

X ---测得加标样本中被测组分残留含量，mg/kg

X----样本中被测组分残留含量，mg/kg;

X——样本理论加标量， mg/kg

6.3相对标准偏差按下面公式(3)计算：

SD(

备注：测定均值X 计算公式为：

5.3定量限与检出限说明

设定样品称重为2克，最终定容体积为2毫升时，本方法对各色素的检测灵敏度规定如下：新红、胭脂红、日落黄、赤藓红、柠檬黄及喹啉黄的检出限为0.5mg/kg，定量限为1.5mg/kg；而苋菜红、诱惑红、酸性红、靛蓝、亮蓝的检出限则更低，为mg/kg，定量限为mg/kg。本方法在接近定量限时进行了加标实验，验证了其灵敏度。

5.4精密度与准确度评估

为确保分析的精确性和准确性，选取饮料和糖果作为典型基质，进行了系统性的加标回收实验。针对新红、胭脂红、日落黄、赤藓红、柠檬黄，分别向两种基质中加入了0.14mL、0.70mL、1.20mL的中间液I，并保持样本最终稀释体积为10.0mL。对于苋菜红、诱惑红、酸性红、靛蓝、亮蓝，加入的中间液I量分别为0.10mL、0.40mL、0.80mL，同样维持样本总体积在10.0mL。喹啉黄的加标量则设定为0.14mL、0.70mL、1.00mL，样本总稀释体积同为10.0mL。所有实验均严格遵循标准前处理流程后进行仪器分析。

实验数据分析显示，各色素的平均回收率落在80%-110%区间内，表明方法具有良好的准确性；同时，精密度（变异系数）控制在10%以内求。

6验证结果评价

为了确保合成着色剂检测方法的准确性和可靠性，对其进行了全面的验证，涵盖了线性、定量限、回收率和精密度等多个关键参数。

6.1线性验证

通过制备一系列浓度梯度的合成着色剂标准溶液，并使用的检测方法进行测量，获得了标准曲线。该曲线的线性良好，表明的检测方法在较宽的浓度范围内都能保持准确的响应，从而确保了检测结果的准确性。

6.2定量限

定量限是指能够可靠地检测并定量的最低浓度。通过多次重复测量低浓度标准溶液，确定了检测方法的定量限。这一参数对于评估检测方法的灵敏度和适用性至关重要。的定量限结果满足相关要求，表明的检测方法能够可靠地检测出低浓度的合成着色剂。

6.3回收率

回收率是指通过检测方法从样品中回收的待测物质的比例。通过向已知浓度的样品中添加已知量的合成着色剂标准品，然后使用的检测方法进行测量，计算回收率。回收率的准确与否直接关系到检测结果的准确性。的回收率结果满足相关要求，证明了的检测方法能够有效地从样品中回收合成着色剂，保证了检测结果的准确性。

6.4精密度

精密度是指多次重复测量同一样品时所得结果的一致性。通过多次重复测量同一浓度的合成着色剂标准溶液，计算其相对标准偏差来评估精密度。精密度的高低反映了检测方法的稳定性和可靠性。的精密度结果满足相关要求，表明的检测方法在多次重复测量时能够保持较好的一致性，从而确保了检测结果的稳定性和可靠性。

通过对合成着色剂检测方法的线性、定量限、回收率和精密度的全面验证，确认了所得数值均满足方法对参数的相关要求。因此，可以放心地开展实验室检测工作，为合成着色剂的质量控制和风险评估提供准确可靠的数据支持。

7实际应用

将该方法应用于市售康师傅饮料与糖果样品中合成色素的检测，进行了一系列详尽的实验分析。首先，收集了不同批次、不同口味的康师傅饮料和糖果样品，确保样本的多样性和代表性。随后，按照之前建立的固相萃取-高效液相色谱法（SPE-HPLC）的检测流程，对这些样品进行了合成色素的提取和定量分析。

实验结果表明，部分康师傅饮料与糖果样品中检出了少量的合成色素。这些合成色素的检出量均处于较低水平，远未达到可能对人体健康产生负面影响的程度。同时，进一步将这些检测结果与国家规定的最大使用量标准进行了对比，结果显示所有样品的合成色素含量均未超过国家标准的限制。

这一结果不仅证实了康师傅饮料与糖果在合成色素使用方面的合规性，也体现了建立的检测方法的准确性和可靠性。通过本研究的实践应用，成功地为康师傅饮料与糖果中合成色素的质量控制提供了有力支持。这一方法的推广和应用，将有助于进一步保障消费者的健康权益，促进食品行业的健康发展。

8结论

本研究建立了基于固相萃取-高效液相色谱法（SPE-HPLC）的饮料与糖果中11种合成色素的检测方法。该方法具有准确度高、灵敏度高、操作简便等优点，可用于饮料与糖果中合成色素的日常检测。通过实际应用表明该方法具有较好的实用性和可靠性。

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