简介：摘要目的从细胞紧密连接蛋白claudin-5的角度探讨血必净注射液改善肺血管屏障功能紊乱的新机制。方法采用硫化氢（H2S）暴露导致急性肺损伤（ALI）模型。①体内实验：按随机数字表法将雄性SD大鼠分为对照组、H2S暴露组（300×10-6 H2S持续暴露3 h）、血必净对照组（静脉注射血必净注射液4 mL/kg、每日2次、持续3 d）、血必净干预组（血必净注射液预处理后予以H2S暴露），每组6只。制模成功后不同时间点（0、6、12、24 h）分别检测大鼠血浆和支气管肺泡灌洗液（BALF）中总蛋白含量，计算肺通透性指数（PPI；PPI＝BALF中总蛋白含量/血浆中总蛋白含量），测定肺湿/干重比值（W/D），用实时定量聚合酶链反应检测肺组织claudin-5 mRNA表达。②体外实验：将人肺微血管内皮细胞株（HPMECs）分为空白对照组、H2S供体（NaHS）处理组（与500 μmol/L NaHS共孵育12 h）、血必净对照组（加入2 g/L血必净注射液培养24 h）、血必净干预组（2 g/L血必净注射液预处理24 h后与500 μmol/L NaHS共孵育12 h）。分别于共孵育不同时间点（1、3、6、12和24 h），用蛋白质免疫印迹试验检测HPMECs细胞claudin-5蛋白表达，以荧光素钠评价单层HPMECs的通透性。结果①体内实验结果：与对照组相比，大鼠H2S暴露后6 h肺W/D比值即显著升高，12 h达峰值（4.67±0.11比4.26±0.06，P<0.01）；肺组织claudin-5 mRNA表达显著降低，暴露后6 h时降至对照组的89%（P<0.01）。暴露后12 h BALF中总蛋白和PPI均显著高于对照组〔总蛋白（mg/L）：262.31±14.24比33.30±3.09，PPI：（11.72±0.57）×10-3比（1.21±0.08）×10-3，均P<0.01〕；而血必净预处理后BALF中总蛋白和PPI均显著下降〔总蛋白（mg/L）：153.25±7.32比262.31±14.24，PPI：（5.79±0.23）×10-3比（11.72±0.57）×10-3，均P<0.01〕。②体外实验结果：与空白对照组相比，HPMECs与NaHS共孵育后单层内皮细胞通透性逐渐增加，12 h达到最高，约为空白对照组的2倍（P<0.01），而claudin-5蛋白表达则于12 h时降至最低（claudin-5/β- actin：0.42±0.03比1.03±0.05，P<0.01）；经血必净干预后可明显改善内皮细胞通透性（荧光素钠的荧光强度：1.46±0.10比1.89±0.11，P<0.01），减轻claudin-5蛋白的下降程度（claudin-5/β- actin：0.68±0.04比0.38±0.03，P<0.01）。结论血必净注射液可能通过上调claudin-5的表达改善ALI时受损的肺血管屏障功能。

简介：摘要目的探讨血必净注射液上调紧密连接蛋白claudin-5表达的信号通路。方法利用脂多糖（LPS）建立急性呼吸窘迫综合征（ARDS）动物模型和细胞模型。①体内实验：将20只雄性SD大鼠随机分为4组，每组5只。正常对照组大鼠不做任何处理；LPS诱导组腹腔注射10 mg/kg LPS 12 h；血必净对照组腹腔注射1 mg/kg血必净注射液，每日2次，连续3 d；血必净干预组用血必净注射液预处理后腹腔注射10 mg/kg LPS 12 h。取大鼠肺脏，检测肺湿/干质量比值（W/D）和大鼠肺组织形态学改变；免疫组织化学染色（IHC）和蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）检测大鼠肺组织claudin-5、磷酸化叉头框蛋白O1（p-FOXO1）、总叉头框蛋白O1（t-FOXO1）、磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（p-Akt）、总Akt（t-Akt）蛋白表达。②体外实验：将人肺微血管内皮细胞（HPMECs）分为6组，每组5孔。正常对照组、血必净对照组（与2 g/L血必净共同孵育24 h）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）通路抑制剂LY294002对照组（与10 μmol/L LY294002共同孵育1 h）、LPS诱导组（与1 mg/L LPS共同孵育12 h）、血必净干预组（用2 g/L血必净预处理24 h后与1 mg/L LPS共同孵育12 h）、LY294002干预组（与10 μmol/L LY294002共同孵育1 h后加入2 g/L血必净孵育24 h，然后再与1 mg/L LPS共同孵育12 h）。用Western blotting检测每组HPMECs中claudin-5、p-FOXO1、t-FOXO1、p-Akt、t-Akt蛋白的表达。结果体内实验结果：①肺组织W/D比值：LPS诱导组较正常对照组显著升高（6.79±0.42比4.19±0.13），经血必净干预后较LPS组明显下降（4.92±0.38比6.79±0.42，P<0.01）。②肺组织形态学改变：与正常对照组比较，LPS诱导组损伤严重，经血必净干预后明显改善。③ claudin-5、p-Akt/t-Akt、p-FOXO1/t-FOXO1蛋白表达水平：LPS诱导组各蛋白均较正常对照组明显降低〔claudin-5蛋白（claudin-5/GAPDH）：0.33±0.03比1.03±0.07，p-Akt/t-Akt：0.18±0.02比1.01±0.13，p-FOXO1/t-FOXO1：0.16±0.06比1.00±0.19，均P<0.01〕；经血必净干预后表达水平较LPS诱导组显著增高〔claudin-5表达（claudin-5/GAPDH）：0.53±0.05比0.33±0.03，p-Akt/t-Akt：0.56±0.12比0.18±0.02，p-FOXO1/t-FOXO1：0.68±0.10比0.16±0.06，均P<0.01〕。体外实验结果：LPS诱导组及血必净干预组claudin-5蛋白均较正常对照组明显降低（claudin-5/β-actin：0.45±0.03、0.80±0.08比1.01±0.15，均P<0.01）；LY294002干预后claudin-5表达较血必净干预组明显下降（claudin-5/β-actin：0.41±0.02比0.80±0.08，P<0.01）。结论血必净通过PI3K/Akt/FOXO1信号通路上调claudin-5，从而改善ARDS的肺血管屏障功能。