简介：摘要： 为考查中药对大肠杆菌的抑菌效果，选取了白头翁、黄连、黄柏等二十余种常见清热解毒、抗菌类药物，进行抑菌试验；分别采用了体外纸片扩散法及体内小白鼠实验，通过观察扩散情况与小白鼠致死及发病情况，考查其对大肠杆菌的抑菌效果。结果显示， 23 种中药水提取液中，黄芩、白头翁、黄连对大肠杆菌的体外抑菌效果最强，可以为临床应用提供理论基础；其次是金银花、黄柏、菊花、陈皮、白芍、栀子、五倍子等；而石榴皮、土茯苓、木香、艾叶这几种中草药对大肠杆菌几乎没有抑制作用。由 复方 1 ： 菊花、五倍子、石菖蒲、 黄芩，与复方 2 ： 大黄、黄芩、石菖蒲和金银花，合二为一组成的复方组合对体内外抑菌效果较为显著。可能是几种不同的中药成分在对大肠杆菌作用过程中产生协同促进作用；而由地榆、白头翁、土茯苓组成的复方 7 ，以及黄连、白头翁、木香和甘草组成的复方 8 ，抑菌效果并不明显，这与代谢过程中的相互抑制作用有关；综合以上，黄芩、白头翁、黄连，以及由石菖蒲、五倍子、黄芩、菊花组成的复方，或由石菖蒲、黄芩、大黄、金银花组成的复方可以为临床应用提供参考。
关键词：中药；大肠杆菌；复方；抑菌效果；小白鼠 猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的一类传染性疾病的总称。 根据猪的生理特性、日龄的增长及免疫状态等特征的不同，导致疾病的发生也存在一定的差异性。 常见的猪大肠杆菌病有以下三种：仔猪黄痢、仔猪白痢和猪水肿病。 1 材料与方法 1.1 试验材料 （ 1 ） 试验动物 健康的小白鼠和疑似患有大肠杆菌病的病猪 （ 2 ） 试验试剂 麦康凯琼脂培养基粉、蛋白胨、牛肉浸膏、琼脂、氯化钠溶液、氢氧化钠溶液 ,超纯水，所有试剂均为分析纯及以上纯度。 （ 3 ） 试验药物 参考《全国中草药汇编》选取了具有清热解毒、抗菌、消炎等疗效的中草药二十余种，具体为：白头翁、黄连、黄柏、秦皮、黄芩、栀子、香附、穿心莲、石菖蒲、五倍子、菊花、大黄、金银花、艾叶、马齿苋、甘草、郁金、诃子、白芍、地榆、石榴皮、土茯苓、木香，以上中药材均购自吉林大药房，所有药物经鉴定均符合生药质量标准。 1.2 试验方法 （ 1 ） 培养基制备 培养基为麦康凯琼脂培养基、肉汤培养基，培养方法按照说明书上的剂量称取，将其加入超纯水，并搅拌在 121℃， 101KPa下灭菌 30min，以备用 （ 2 ） 细菌的分离 第一， 菌种采集：大肠杆菌菌种采集自疑似患有猪大肠杆菌的病猪。 第二， 菌种培养：首先使用温水和脱脂棉清洗患有白痢的仔猪肛门部位，再用 75% 的酒精棉球和碘酊进行消毒。经过彻底清洁、消毒后，将无菌棉拭子插入肛门内，采集直肠粪便病料。随后将样品棉拭子放入无菌生理盐水的 10 ml 离心管中，密封保存于 4℃ 冰盒中，快速送至实验室。按照麦康凯琼脂培养基粉说明书要求，制备麦康凯琼脂培养基，于 37℃ 过夜检菌后使用。在超净工作台上，将采集的粪便棉拭子涂布于合格的麦康凯琼脂培养基中，在生化培养箱中，在 37 的环境下，倒置培养 1824 h 。观察培养基，用平板划线法为初步分离的大肠杆菌分离株并且进行分离纯化，重复培养 3-5 次。将其接种于营养肉汤中，并置于振荡培养器中处于 37 ， 180 r/min 培养 8 h 后采用甘油保存法，与 30% 甘油混合置于 -80℃ 保存、备用，每个菌种保存三管。 第三， 镜检：菌体形态通过革兰氏染色，经过初染、媒染、脱色、复染之后，将载玻片覆上盖玻片，置于 Classica E220LED 双目光学显微镜下观察，拍照记录菌体形态，包括菌体形状、大小、排列方式和革兰氏阴阳性等。 第四， 生理生化鉴定：将分离出的大肠杆菌进一步试验，如： VP 试验和尿酶试验、糖发酵试验、三糖铁试验、 MR 试验等各种发酵实验。 第五， 动物试验：将纯化的大肠杆菌肌肉注射到小白鼠体内，观察小白鼠的生命体态。 （ 3 ） 中药试剂的选择 将单味中草药按照中药配制原则、药理、药性并与常用方剂（如白头翁汤）组成八种复方 ： 复方 1 为 石菖蒲、黄芩、菊花、五倍子 ； 复方 2 为 石菖蒲、大黄、金银花、黄芩 ； 复方 3 为 大黄、秦皮、艾叶、黄芩 ； 复方 4 为 白头翁、黄柏、秦皮、黄连 ； 复方 5 为 马齿苋、黄柏、五倍子、甘草、白头翁 ； 复方 6 为 郁金、白芍、诃子、黄柏、黄芩、栀子、大黄、黄连 ； 复方 7 为 地榆、土茯苓、石榴皮 ； 复方 8 为 黄连、木香、甘草、白头翁 。 （ 4 ） 药敏实验 第一， 药液制备：分别制备复方 1 至 8 中草药水提液且采用水煎法。分别称取粉碎后的中草药复方制剂 50 g ，置于 500 mL 烧杯中，加入 400 mL 超纯水，浸泡 1 h 后，强火加热至沸腾，改用文火煎煮 30min ， 4 层纱布过滤，药渣再加入适量超纯水，按上述方法煎煮过滤除去滤渣，合并 2 次滤液，分别制备复方 1 至 8 中草药水提液且采用水煎法。将其分别装入 8 个 100 ml 生理盐水瓶在 121 ℃ 、 101 KPa 条件下灭菌 30 min ，灭菌后，置于 4 ℃ 冰箱中保存，备用。 第二， 纸片制备：取滤纸，用打孔机打成圆形小纸片，取圆形纸片 80 个放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口使用单层牛皮纸包扎。经高温高压消毒后放入 37 ℃ 恒温烘箱中，使其完全干燥。 第三， 抗菌纸片制作：将上述 80 个纸片均匀分为八组每组 10 个，然后分别放在药液 1 至 8 中。使各纸片充分浸透药液。于 37 ℃ 下过夜干燥后及密封。 第四， 药敏实验：在无菌条件下将培养 24 h 的肉汤培养物，用灭菌生理盐水稀释 10 倍，取 0.2 mL 滴加在琼脂平板培养基上，用灭菌棒涂匀，平板置于超净工作台上，在室温下干燥 3-5min ，用无菌镊子将含药纸片紧贴于琼脂表面，等距离放置纸片；置 35℃ 恒温箱内倒置培养 18h 后，观察结果。 2 试验结果 2.1中药对大肠杆菌的体外抑菌作用 23 种中药在琼脂纸板上的抑菌圈直径大小 ： 黄芩 ， 抑菌圈直径 1.78mm ， 抑菌效果最好 ； 白头翁 ， 抑菌圈直径 1.65mm ， 抑菌效果最好 ； 黄连 ， 抑菌圈直径 1.58mm ， 抑菌效果最好 ； 金银花 ， 抑菌圈直径 1.45mm ， 抑菌效果良好 ； 黄柏 ， 抑菌圈直径 1.44mm ， 抑菌效果良好 ； 菊花 ， 抑菌圈直径 1.32mm ， 抑菌效果良好 ； 秦皮 ， 抑菌圈直径 1.31mm ， 抑菌效果良好 ； 白芍 ， 抑菌圈直径 1.26mm ， 抑菌效果良好 ； 栀子 ， 抑菌圈直径 1.26mm ， 抑菌效果良好 ； 五倍子 ， 抑菌圈直径 1.22mm ， 抑菌效果良好 ； 地榆 ， 抑菌圈直径 1.13mm ， 有抑菌效果，但不明显 ； 马齿苋 ， 抑菌圈直径 1.12mm ， 有抑菌效果，但不明显 ； 石菖蒲 ， 抑菌圈直径 1.05mm ， 有抑菌效果，但不明显 ； 大黄 ， 抑菌圈直径 1.05mm ， 有抑菌效果，但不明显 ； 香附 ， 抑菌圈直径 1.05mm ， 有抑菌效果，但不明显 ； 穿心莲 ， 抑菌圈直径 0.98mm ， 有抑菌效果，但不明显 ； 甘草 ， 抑菌圈直径 0.98mm ， 有抑菌效果，但不明显 ； 郁金 ， 抑菌圈直径 0.96mm ， 有抑菌效果，但不明显 ； 诃子 ， 抑菌圈直径 0.96mm ， 有抑菌效果，但不明显 ； 石榴皮 ， 抑菌圈直径 0.90mm ， 几乎没有抑菌效果 ； 土茯苓 ， 抑菌圈直径 0.90mm ， 几乎没有抑菌效果 ； 木香 ， 抑菌圈直径 0.90mm ， 几乎没有抑菌效果 ； 艾叶 ， 抑菌圈直径 0.90mm ， 几乎没有抑菌效果 ； 生理盐水 ， 抑菌圈直径 0.90mm ， 几乎没有抑菌效果 。综上， 这 23 种中药大多数都能对大肠杆菌产生抑菌作用，其中，黄芩，白头翁，黄连的抑菌效果最好，金银花，黄柏，菊花等其次，但石榴皮、土茯苓、木香及艾叶在体外对大肠杆菌几乎没有抑菌作用。 2.2复方中草药的体外抑菌效果测试 8 种复方对大肠杆菌的体外抑菌效果 ： 复方 1 - 抑菌圈直径 2.58mm - 抑菌效果最好 ； 复方 2- 抑菌圈直径 2.42mm - 抑菌效果最好 ； 复方 3- 抑菌圈直径 1.12mm - 有 抑菌效果 ，但不明显； 复方 4- 抑菌圈直径 2.15mm - 抑菌效果最好 ； 复方 5- 抑菌圈直径 1.06mm - 有 抑菌效果 ，但不明显； 复方 6- 抑菌圈直径 1.18mm - 有 抑菌效果 ，但不明显； 复方 7- 抑菌圈直径 0.98mm - 有 抑菌效果 ，但不明显； 复方 8- 抑菌圈直径 1.22mm - 抑菌效果良好 ； 生理盐水 - 抑菌圈直径 0.90mm - 抑菌效果良好 - 没有抑菌效果 。综上， 多数的组合复方都比单一中药的作用效果更明显；其中由石菖蒲、五倍子、黄芩、菊花组成的复方 1 抑菌效果显著比单一中药效果好，其次，由石菖蒲、黄芩、大黄、金银花组成的复方 2 体外抑菌效果也比较好，而由地榆、石榴皮、土茯苓组成的复方 7 的体外抑菌效果比单一地榆的效果更差，原因可能是几种药物在与大肠杆菌发生作用的代谢过程中产生了抑制作用。 2.3复方中草药的体内抑菌测试 按照几种复方的配制，将中药水提取液注入 8 只 小白鼠体内观察得到的情况 ： 复方 1 ，死亡 0 只，死亡率 0.0% ， 小白鼠状态良好，能够进行正常活动，无不良反应 ； 复方 2 ，死亡 0 只，死亡率 0.0% ， 小白鼠状态较好，活动量较正常情况微少 ； 复方 3 ，死亡 1 只，死亡率 12.5% ， 小白鼠状态不佳，活动量减少至少一半 ； 复方 4 ，死亡 0 只，死亡率 0.0% ， 小白鼠状态良好，能够进行正常活动，无不良反应 ； 复方 5 ，死亡 2 只，死亡率 25% ， 小白鼠状态很差，活动量小或几乎不活动 ； 复方 6 ，死亡 2 只，死亡率 25% ， 小白鼠状态很差，活动量小或几乎不活动 ； 复方 7 ，死亡 3 只，死亡率 37.5% ， 小小白鼠状态很差，活动量小或几乎不活动 ； 复方 8 ，死亡 2 只，死亡率 25% ， 小白鼠状态很差，活动量小或几乎不活动 ； 生理盐水 ，死亡 8 只，死亡率 100% ， 小白鼠状态很差，活动量小或几乎不活动 。 其中复方 1 抑菌效果显著，其次，复方 2 ，复方 4 体内抑菌效果也比较好，这与体外琼脂纸板扩散实验的结果的一致的；而由地榆，石榴皮，土茯苓组成的复方 7 ，以及有黄连、白头翁、木香、甘草组成的复方 8 ，效果相对较差，原因可能与代谢过程中的相互抑制作用有关。 3 分析与讨论 本课题主要探索了白头翁、黄连、黄柏、秦皮、黄芩、栀子、香附、穿心莲、石菖蒲、五倍子、菊花、大黄、金银花、艾叶、马齿苋、甘草、郁金、诃子、白芍、地榆、石榴皮、土茯苓、木香，这 23 种清热，抗菌的中草药，通过试验得出对大肠杆菌抑菌作用最强的是黄芩、白头翁以及黄连。体内及体外抗菌试验中对大肠杆菌抑菌效果最强的是由石菖蒲、五倍子、黄芩和菊花组成的复方以及由石菖蒲、黄芩、大黄和金银花组成的复方 ， 为兽医临床应用上提供参考。 参考文献 [1]李美发 ,陈作栋 ,梁欢 ,柏峻 ,赵二龙 ,易中华 ,瞿明仁 ,许兰娇 .单一中草药以及复方中草药体外抑菌效果研究 [J].饲料工业 ,2019,40(12):22-26. [2]杨明凡 ,高航 ,万博 ,李庆华 ,陈红英 ,张红英 ,夏平安 .猪源大肠杆菌分离鉴定及白头翁汤对其抑菌试验 [J].中国兽医杂志 ,2019,55(05):55-57+121. [3]陈敏卿 .猪大肠杆菌的分离鉴定及其药敏试验 [J].福建畜牧兽医 ,2018,40(06):14-16. 5
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