简介：β-胡萝卜素-15,15＇-加氧酶（β-carotene-15,15＇-momoxygenase1,bco1）是β-胡萝卜素转化成维生素A过程中的关键酶,bco1与bco1l是编码此酶的主要基因。本实验利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼的与β-胡萝卜素-15,15＇-加氧酶编码相关的基因bco1与bco1l,以便深入开展对斑马鱼bco1的功能研究。分别在斑马鱼bco1与bco1l基因2号外显子选取sgRNA识别位点,体外转录制备sgRNA并与Cas9mRNA混合对斑马鱼Ⅰ细胞期受精卵进行显微注射,24h后收集部分胚胎进行PCR检测并将PCR产物进行单克隆测序确定sgRNA的有效性,构建首建鱼,并在此基础上通过PCR检测、凝胶电泳及测序筛选可遗传突变体。本研究分别获得了bco1基因突变与bco1l基因突变,分析表明这些缺失和插入均可导致编码序列的移码,为研究鱼类胡萝卜素代谢及相关发育过程等后续研究提供了材料。

简介：摘要：

简介：摘要： CRISPR-Cas9技术是一种高效、精准、可重复的基因编辑工具，已经在生物学工程领域得到广泛应用。本文综述了CRISPR-Cas9技术在基因敲除、修饰、添加和调控等方面的应用研究，以及相关的应用案例和未来发展趋势。在植物基因编辑方面，CRISPR-Cas9技术已经成功应用于水稻、小麦、番茄等重要农作物的基因改良；在动物基因编辑方面，CRISPR-Cas9技术已经实现了猪、牛、鼠等动物的基因敲除和修饰；在微生物基因编辑方面，CRISPR-Cas9技术已经被广泛应用于工业微生物的基因改良和代谢工程。未来，随着CRISPR-Cas9技术的不断发展和完善，它将在生物学工程领域发挥越来越重要的作用，为生物学研究和生物技术开发带来更多的机遇和挑战。

简介：摘要目的基于重组酶介导的扩增技术(recombinase aided amplification，RAA)和CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas13a(CRISPR-associated protein 13a)检测，建立一种快速、灵敏且特异的重要境外输入性病毒检测方法。方法以流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、黄热病毒(Yellow fever virus，YEV)、西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)、中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)、埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)、登革病毒(Dengue virus，DENV)、裂谷热病毒(Rift Valley fever virus，RVFV)、寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)为检测对象，设计特异性RAA扩增引物和CRISPR RNA(crRNA)，建立RAA扩增结合CRISPR-Cas13a蛋白检测反应，评价方法的灵敏度和特异性，使用登革热疑似临床样本进行检测，并与荧光RT-PCR技术进行比较，同时检测其余7种病毒临床模拟样本。结果RAA扩增结合CRISPR-Cas13a蛋白检测方法能在39 ℃条件下，40~52 min内检测出8种输入性传染病病原体，灵敏度达到1~10拷贝/μl，并且这8种病原体之间无交叉反应，临床样本均可100%检测出。结论建立的RAA扩增结合CRISPR-Cas13a蛋白检测方法能够灵敏、特异且快速地检测出8种境外输入性传染病病原体。

简介：研究表明，雌激素在诱导乳腺癌发生和细胞增殖方面起到重要的作用。雌激素及其受体组成的蛋白复合体作用于乳腺细胞，促进多种基因的转录调节。临床上，大约2／3的乳腺癌雌激素受体（ER）阳性，且具备生物活性功能，能促进和维持乳腺肿瘤细胞的生长。因此，临床上通过检查乳腺癌细胞是否含有ER，和ER对雌激素的应答性来决定是否应用抗雌激素药物。

简介：CRISPR/Cas9（Clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeat/Cas9）基因编辑技术在生命科学领域掀起了一场重大的技术革命,它比锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子效应物核酸酶（TALENs）技术更易于操作,而且更高效。CRISPR/Cas9系统已经被广泛应用到植物科学研究领域中。本实验选取拟南芥MS2为目的基因,构建植物基因编辑系统的表达载体,并通过农杆菌介导的方法转化拟南芥,从而利用CRISPR/Cas9系统靶向敲除拟南芥MS2基因。对转基因后代的MS2测序结果分析表明,在获得的12个阳性转化植株中,发现了5个阳性植株存在基因序列上的新碱基插入,由此形成CRISPR/Cas9介导的拟南芥MS2突变体。这一工作为后续分析其他物种中MS2同源基因的功能研究提供参考依据。

简介：摘要第二大类成簇规律间隔短回文重复序列与相关蛋白（CRISPR-Cas）包括靶向编辑双链DNA的Cas9、Cas12系统和靶向编辑单链RNA的Cas13系统。与传统的锌指核酸酶和转录激活样因子效应物核酸酶相比，第二大类CRISPR-Cas系统具有操作简单，特异性好，效率高等优点。近年来，第二大类CRISPR-Cas系统在妇科恶性肿瘤领域被广泛应用。因此，本文就其在妇科恶性肿瘤研究模型建立、肿瘤发病及耐药机制、功能基因筛选和靶向治疗等领域的研究进展进行综述。

简介：Wereportanovelapproachtoobtainingaclassicalblue-greenexcitableCaS:Eu2+phosphorwithdesiredredemissionbymicrowave(MW)firingprocedureintheabsenceofaddingelementalsulphur.ThedisturbingeffectofMWelectromagneticfieldondecompositionofCaSO4intoCaSactivatedbyeuropiumisdistinctlyobservedtogivepurehostphasewithoutaddinganyelementalsulphurandcarbon.ThehostphaseevolutionisobservedtobehighlydependentonthevariationofappliedMWpowerfromX-raydiffraction(XRD)patternsandthecorrespondingphotoluminescence(PL),andamaximumPLintensityat1100WofMWpowerisacquiredfortheobtainedpurerhostphase.Thenon-thermalandnon-equilibriumeffectsbyMWarerevealedtocorrelatewiththeinteractionbetweenpolarstructureofthehostandappliedelectromagneticfield.Theresultsdemonstrateanoptionalproceduretopreparethisred-emittingphosphorinaneffective,environment-friendlyandscalableapproachforphosphorproductionintheapplicationofbio-illuminationforplantcultivationandartificialphotosynthesis.

简介：

简介：Pheromone-bindingproteins(PBPs)arethoughttobindandtransportsexpheromonesontotheolfactoryreceptorsonthedendritemembraneofolfactoryneurons,andthusplayavitalroleinsexpheromoneperception.However,thefunctionofPBPshasrarelybeendemonstratedinvivo.Inthisstudy,twoPBPs(PBP1andPBP3)ofChilosuppressalis,oneofthemostnotoriouspyralidpests,wereinvivofunctionallycharacterizedusinginsectswiththePBPgeneknockedoutbytheCRISPR/Cas9system.First,throughdirectinjectionofPBP-singleguideRNA(sgRNA)/Cas9messengerRNAintonewlylaideggs,ahighrateoftarget-geneediting(checkedwithpolledeggs)wasinducedat24hafterinjection,21.3%forPBPl-sgRNAinjectedeggsand19.5%forPBP3-sgRNAinjectedeggs.Second,byanin-crossingstrategy,insectswithmutantPBP1orPBP3(bothwithaprematurestopcodon)werescreenedandhomozygousmutantswereobtainedintheG3generation.Third,themutantinsectsweremeasuredforelectroantennogram(EAG)responsetofemalesexpheromones.Asaresult,bothPBPmutantmalesdisplayedsignificantreductioninEAGresponse,andthisreductioninPBP1mutantswashigherthanthatinPBP3mutants,indicatingamoreimportantroleofPBP1.Finally,therelativeimportanceoftwoPBPsandthepossibleofftargeteffectinducedbysgRNA-injectionarediscussed.Takentogether,ourstudyprovidesadeeperinsightintothefunctionofandinteractionbetweendifferentPBPgenesinsexpheromoneperceptionofC.suppressalis,aswellasavaluablereferenceinmethodologyforgenefunctionalstudyinothergenesandothermothspecies.

简介：摘要：本研究通过CRISPR/Cas9技术敲除PD-1基因，成功构建了具有更高增殖、细胞因子分泌和细胞毒性能力的EGFR-CAR-PD-1-KO T细胞，相比于EGFR-CAR T细胞。在体内实验证明，EGFR-CAR-PD-1-KO T细胞能更有效地抑制肺癌细胞生长和转移，延长小鼠生存期。这为通过CRISPR/Cas9技术增强CAR-T细胞对肺癌的抗肿瘤活性提供了新的策略。

简介：摘要目的探究敲减角质形成细胞KRT5基因对共培养黑素细胞黑素含量的影响，以解释屈侧网状色素沉着症（DDD）的色素增加性皮损形成的机制。方法通过成簇的规律间隔的短回文重复序列-相关蛋白9（CRISPR-Cas9）技术获得KRT5基因杂合突变的HaCaT细胞，将转染非靶向单向导RNA：Cas9蛋白复合物的HaCaT细胞设为对照组，分别与人原代黑素细胞HEMn体外共培养。免疫荧光观察共培养细胞中细胞角蛋白及黑素小体表达；差异胰酶消化获得不同共培养组中黑素细胞，检测细胞内黑素含量。免疫组化检测1例KRT5突变DDD患者皮损和正常对照皮肤中黑素细胞特异性前黑素小体蛋白17（Pmel17）的表达改变。结果Sanger测序显示，实验组HaCaT细胞KRT5基因第1外显子起始密码子发生杂合突变（c.1delA），对照组HaCaT细胞KRT5基因未发生突变。Western印迹显示，实验组HaCaT细胞KRT5蛋白表达水平（0.60 ± 0.05）显著低于对照组（1.00 ± 0.00，t = 32.38，P = 0.001）。HEMn细胞与实验组HaCaT细胞共培养体系中Pmel17标记的黑素小体较与对照组共培养体系增多，且细胞内黑素含量增加52.5%，差异具有统计学意义（t = -3.48，P = 0.025）。KRT5突变DDD患者皮损组织中Pmel17表达量较正常对照皮肤增加。结论本研究通过CRISPR-Cas9诱导KRT5基因突变的HaCaT细胞，与黑素细胞在体外建立共培养细胞模型，验证了其对共培养黑素细胞的影响，为进一步研究角质形成细胞与黑素细胞相互作用机制以及皮肤色素异常的发病机制提供了初级研究模型。

简介：摘要目的构建线粒体抗病毒信号(mitochondrial antiviral signaling, MAVS)和核因子κB1(nuclear factor kappa B1, NFκB1)基因敲除的犬肾细胞系(Madin-Daby canine kidney cells, MDCK)，对细胞系的生长特性、流感病毒(influenza virus, Flu)的增殖特性进行初步鉴定。方法采用CRISPR/Cas9技术，将MDCK细胞的MAVS和NFκB1基因敲除，获得稳定的敲除细胞系。接种Flu并检测培养上清中病毒的血凝(hemagglutinination, HA)滴度和TCID50滴度，与野生MDCK细胞进行比较。结果获得2株稳定敲除的MDCK细胞系MDCK-MAVS－和MDCK-NFκB1－，与野生MDCK细胞同样为贴壁的上皮样细胞。接种Flu后，2株敲除细胞系测定的病毒HA滴度与野生细胞相比无明显差异，TCID50分别比野生MDCK细胞系提高了9.5倍和10倍，其差异有统计学意义(P＝0.0316)。结论本研究构建的2株基因敲除细胞系MDCK-MAVS－和MDCK-NFκB1－能够提高Flu的感染力，为Flu的分离培养提供了新的候选细胞系。

简介：摘要目的通过突变整合于宿主细胞中的人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)16型的E6、E7致癌基因，探索预防和治疗宫颈癌的新方法。方法以SiHa细胞系为研究对象，设计靶向其内整合的HPV16 E6和E7基因的小引导RNA(small guide RNA，sgRNA)，将其克隆入CRISPR/Cas9质粒，并应用其将E6、E7基因敲除，随后应用错位酶切法和克隆测序检测突变效果，并用细胞迁移与侵袭实验检测细胞的侵袭力。结果设计的sgRNA被克隆入CRISPR/Cas9质粒，经测序克隆正确。该质粒转染SiHa细胞后，可以引发靶点DNA的突变，致使E6和E7基因密码子改变，无法正确表达。E6、E7突变后SiHa细胞侵袭及增殖能力下降(t检验，pCas9组与psgE6-1-1-Cas9组相比，P＝0.0006; pCas9组与psgE7-1-2-Cas9组相比，P＝0.0007)，促进肿瘤抑制因子P53的表达恢复，细胞的恶性度降低。

简介：摘要目的构建表达视觉系统同源框2(VSX2)增强绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因的人诱导多能干细胞系(hiPSCs)。方法根据成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术原理，设计VSX2的小向导RNA(sgRNA)，构建敲除质粒及包含左右同源臂的P2A-eGFP供体质粒；2个质粒经测序鉴定后电转野生BC1-hiPSCs细胞系，采用嘌呤霉素筛选获得单克隆，扩增培养并鉴定。采用PCR和Sanger测序鉴定基因型；采用核型分析法分析报告细胞系核型；采用STR法排除细胞交叉污染；采用免疫荧光法及逆转录PCR法检测报告细胞系的多能干细胞分子标志物的表达；通过体外三胚层形成实验鉴定报告细胞系向三胚层分化的能力；应用3D视网膜类器官诱导技术获得视网膜类器官，并采用免疫荧光染色法评价VSX2蛋白与eGFP的共定位情况。结果电转后通过PCR鉴定和Sanger测序成功筛选到1株含有VSX2-eGFP报告基因的hiPSC系。核型分析结果显示该报告细胞系核型正常。STR鉴定结果表明，BC1-VSX2eGFP-iPSCs无细胞系交叉污染。逆转录PCR检测和免疫荧光染色表明，BC1-VSX2eGFP-iPSCs中iPSCs标志物基因和蛋白表达阳性，包括NANOG、OCT4、SOX2、DNMT3B和GDF3 mRNA以及NANOG、OCT4、SSEA4和TRA-1-60蛋白。免疫荧光染色表明，由BC1-VSX2eGFP-iPSCs分化的三胚层组织中内胚层标志物甲胎蛋白(AFP)、中胚层标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和外胚层标志物神经细胞特异性微管蛋白(TUJ1)表达均为阳性；eGFP与VSX2共表达于视网膜类器官的神经视网膜。结论成功构建1株表达VSX2-eGFP报告基因的hiPSCs，该细胞系可实时指示VSX2蛋白的时空表达变化，为视网膜发育、疾病机制研究及治疗方法评价提供有力工具。

简介：摘要人诱导多潜能干细胞（hiPSC）可定向分化为眼特定细胞组织，在视网膜细胞移植、角膜移植、晶状体再生等领域有应用前景；成簇规律间隔短回文重复序列/相关蛋白核酸酶（CRISPR/Cas9）基因编辑技术可以高效向hiPSC引入眼遗传病特异突变，将携带眼遗传病基因的hiPSC分化为特定的细胞类型，在体外建立眼遗传病模型或建立体外筛选平台寻找治疗性药物，还可纠正基因组中的遗传突变用于细胞治疗。两者的结合正在为眼再生医学及眼遗传病的基因治疗带来革命性的突破。本文对hiPSC的应用及其与基因编辑技术结合在眼相关遗传病的研究展开综述。（中华眼科杂志，2021，57：712-716）

简介：摘要目的构建跨膜蛋白超家族6成员2（Tm6sf2） E167K基因敲入小鼠模型。方法构建同时表达针对小鼠Tm6sf2基因特定位点的单链向导RNA Cas9的质粒和携带Tm6sf2 E167K片段的Donor质粒，将上述2质粒一起注射入小鼠受精卵，通过PCR检测和测序验证得到F0代阳性小鼠。统计F2代中野生（Wt）、杂合和敲入（KI）3种基因型小鼠的存活数量。选取F2代同窝Wt和KI雄性小鼠（8只/组）给予普通饮食8周，每周记录小鼠的体质量，检测两种小鼠葡萄糖代谢和脂质代谢等指标。组间比较采用独立样本t检验。结果基因型检测和测序结果表明Tm6sf2 E167K基因敲入小鼠模型建立成功。KI小鼠不存在胚胎纯合致死的表型。哺乳期内KI小鼠较Wt小鼠的体质量升高，两组差异有统计学意义（P < 0.05）。KI小鼠的空腹血糖（9.50±0.33）mmol/L较Wt小鼠的空腹血糖（7.80±0.30）mmol/L升高，两组差异有统计学意义（P < 0.05）；KI小鼠的口服葡萄糖耐量试验2 h血糖（9.20±0.51）mmol/L较Wt小鼠的口服葡萄糖耐量试验2 h血糖（7.60±0.18）mmol/L升高，两组差异有统计学意义（P < 0.05）。KI小鼠的肝脏甘油三酯含量（8.40±0.55）mg/g较Wt小鼠的肝脏甘油三酯含量（7.30±0.63）mg/g升高，但差异无统计学意义（P < 0.05）；两种小鼠的血浆甘油三酯水平差异无统计学意义（P > 0.05）；肝脏油红O染色结果显示KI小鼠较Wt小鼠的肝小叶中央区有更多的脂质累积。结论Tm6sf2 E167K基因敲入小鼠构建成功。Tm6sf2 E167K基因敲入可引起小鼠葡萄糖代谢的异常，促进肝脏脂肪变性的发生。

简介：摘要目的比较CAS和CHA2DS2-VASc评分两种卒中风险评估模型预测非瓣膜性心房颤动（房颤）患者全因死亡、血栓栓塞、大出血事件以及复合终点发生方面的差异。方法本研究为回顾性队列研究。从中国房颤注册研究（CAFR）中，选取年龄>18岁的非瓣膜性房颤患者，随机分为CAS评分组和CHA2DS2-VASc评分组，并根据基线和随访过程中抗凝状态筛选出2组中依从评分规范抗凝的患者纳入本研究。收集并比较两组患者的年龄、性别等基本信息，并定期进行随访，随访内容包括是否接受抗凝治疗以及终点事件。终点事件为全因死亡、血栓栓塞和大出血事件，复合终点事件为全因死亡和血栓栓塞事件。分析CAS评分组和CHA2DS2-VASc评分组相关终点事件发生情况，并采用多因素Cox比例风险模型比较两组相关终点事件发生率的差异。结果共纳入5 206例房颤患者，年龄（63.6±12.2）岁，女性2 092例（40.2%）。其中CAS评分组2 447例（47.0%），CHA2DS2-VASc评分组2 759例（53.0%）。CAS组左心室射血分数<55%、非阵发性房颤、口服华法林比例以及HAS-BLED评分低于CHA2DS2-VASC组，而既往糖尿病病史和抗血小板药物服药史比例高于CHA2DS2-VASC组，其余基线资料差异无统计学意义。随访（82.8±40.8）个月，CAS评分组中有225例（9.2%）发生全因死亡，186例（7.6%）发生血栓栓塞事件，81例（3.3%）发生大出血事件，368例（15.0%）发生复合终点事件。CHA2DS2-VASc评分组有261例（9.5%）发生全因死亡，209例（7.6%）发生血栓栓塞事件，112例（4.1%）发生大出血事件，424例（15.4%）发生复合终点事件。两组患者在全因死亡、血栓栓塞、大出血事件以及复合终点事件发生方面差异均无统计学意义（log-rank P值分别为0.643、0.904、0.126、0.599）。Cox多因素回归分析结果也显示，两组患者在全因死亡、血栓栓塞、大出血事件以及复合终点发生方面差异均无统计学意义，HR值（95%CI）分别为0.95（0.80~1.14）、1.00（0.82~1.22）、0.83（0.62~1.10）、0.96（0.84~1.11），P均>0.05。结论在中国非瓣膜性房颤患者中，CAS评分和CHA2DS2-VASc评分在预测全因死亡、血栓栓塞事件以及大出血事件方面效价相同。

简介：摘要目的比较CAS-R-2无框架脑立体定向仪与Leksell框架立体定向仪辅助钻孔引流术治疗高血压性脑出血(血肿量20~40 mL)患者的简易性、疗效、安全性、社会经济负担和预后的不同。方法选择聊城市人民医院脑科医院神经外科自2012年12月至2019年12月收治的120例幕上高血压性脑出血患者，其中应用CAS-R-2无框架脑立体定向仪辅助钻孔引流术治疗65例(无框架组)，应用Leksell框架立体定向仪辅助钻孔引流术治疗55例(有框架组)。回顾性分析患者的临床资料，比较2组患者的手术时间、术后7 d的血肿排空率、住院期间再出血和颅内感染发生率、住院时间和住院费用、术后6个月改良Rankin量表(mRS)评分的差异。结果无框架组患者的手术时间[(0.5±0.1) h vs. (2.2±0.5) h]、住院期间再出血率(0.0% vs. 9.1%)和颅内感染发生率(1.5% vs. 9.1%)均低于有框架组，差异有统计学意义(P<0.05)。有框架组患者的住院费用低于无框架组，差异有统计学意义(P<0.05)。2组患者术后7 d的血肿排空率、住院时间、治疗后6个月死亡率及mRS评分的差异均无统计学意义(P>0.05)。结论CAS-R-2无框架脑立体定向仪与Leksell框架立体定向仪辅助钻孔引流术治疗高血压性脑出血的疗效和预后相同，但前者操作简易性和安全性高，后者的费用低。

简介：【摘要】