研究mTOR抑制剂依维莫司在体外对人前列腺癌PC-3细胞株的作用及其机制

研究mTOR抑制剂依维莫司在体外对人前列腺癌PC-3细胞株的作用及其机制

贺文彦张建勋刘安郭亚雄高旭王涛

陕西延安人民医院716000

摘要：目的：体外研究mTOR抑制剂依维莫司（Everolimus，RAD001）对人前列腺癌PC-3细胞株增殖的改变，并探讨其可能的作用机制。方法：体外采用细胞培养技术培养人前列腺癌PC-3细胞株，MTT法检测依维莫司1nmol/L对PC-3细胞株增殖的变化；流式细胞分析技术（FCM）检测维莫司对PC-3细胞株细胞周期的变化；Westernblot检测依维莫司干预PC-3细胞株后，p-4E-BP1和p-P70-S6K表达情况的改变。采用SPSS13.0统计软件对实验所得数据分析，P＜0.05有统计学差异。结果：MTT结果显示，依维莫司可抑制PC-3细胞株的增殖，且随着药物干预时间的延长，抑制率逐步增大（P<0.01）；FCM结果显示，随着药物干预时间的延长，G0/G1期的细胞百分比逐步升高，S、G2/M期的细胞百分比逐步降低，使绝大部分PC-3细胞被中断在细胞周期的G0/G1期（P＜0.01）；Westernblot结果显示，随着药物干预时间的延长，p-4E-BP1和p-P70-S6K的表达逐步被抑制（P<0.01）。结论：mTOR抑制剂依维莫司能够抑制人前列腺癌PC-3细胞株的增殖，其机制可能与PI3K/Akt/mTOR信号传导通路中的mTOR被抑制，继而抑制了其下游的翻译抑制因子eIF-4E结合蛋白1（4E-BP1）和核糖体蛋白P70-S6K的磷酸化有关。

关键词：依维莫司（Everolimus，RAD001）；mTOR；前列腺癌；PC-3细胞株；增殖

[ABSTRACT]Objective：ToresearchofchangesofmTORinhibitorsEverolimus（RAD001）onproliferationofhumanprostatecancerPC-3celllinesinvitro，andsearchforitspossiblemechanism.Methods：HumanprostatecancerPC-3celllineswerecultivatedinvitrobyCellculturetechnologyandtheninterferedwithby1nmol/lEverolimus.ChangesofEverolimusontheproliferationofPC-3celllineswasdetectedbyMTTassay；TheinfluenceofEverolimusonthecellcyclechangewasdetectedbyFlowcytometryanalysis（FCM）；ThechangesofEverolimusonexpressionofp-4E-BP1andp-P70-S6KwasdetectedbyWesternblotanalysis.ExperimentaldateswereanalyzedbySPSS13.0，andP<0.05isdefinedasaStatisticallysignificantdifference.Results：MTTassaysresultssuggestedthatEverolimuscaninhibittheproliferationofPC-3celllines，andwiththeextensionofdruginterventiontime，theinhibitionraterisegradually（P<0.01）；TheresultsofFlowcytometryanalysis（FCM）revealedthat，withtheextensionofdruginterventiontime，thecellproportionofG0/G1phaserisesgradually，thecellproportionofS，G2/Mphasedeclinegradually，andmakethemostofthePC-3cellsareinterruptedinG0/G1phaseofthecellcycle（P<0.01）；Westernblotanalysisshowedthat，withtheextensionofdruginterventiontime，theexpressionofp-4E-BP1andp-P70-S6Kweregraduallysuppressed（P<0.01）.Conclusions：mTORinhibitorsEverolimuscaninhibittheproliferationofPC3celllines，itsmechanismmayberelatedtothemTORsuppressedofPI3K/Akt/mTORsignalingpathways，andthenwhichinhibitstranslationinhibitoryfactoreIF-4Ebindingprotein1（4E-BP1）andribosomalproteinP70-S6Kofitsdownstreamphosphorylation.

Keywords：Everolimus（RAD001）；mTOR；Prostatecancer；PC-3celllines；proliferation

前列腺癌是危害老年男性健康常见肿瘤，其发病率世界第二，美国第一，我国也逐年上升。经药物或手术去势阻断雄激素是晚期前列腺癌的首选治疗方式，在经治疗15-20个月后，它将转变为稳定的“去势抵抗”状态，即所谓的“去势抵抗性前列腺癌（CRPC）”。

依维莫司是PI3K/Akt/mTOR通路中重要蛋白mTOR的抑制剂，是雷帕霉素（Rapamycin，RAPA）羟乙基醚衍生物，属于抑制肿瘤细胞生长、破坏肿瘤细胞通讯激酶类药物，现主要用来医治晚期肾细胞癌（RCC）。有研究证实，对于多种人类肿瘤细胞和肿瘤异种移植模型，依维莫司具有显著的抗增殖作用，而且还具有显著的抗血管生成特性[1]。鉴于此，本文旨在分析其在体外对人前列腺癌PC-3细胞株的作用及机制，为寻求CRPC新的治疗方法提供理论依据。

1.材料与方法

1.1主要材料与仪器

人前列腺癌PC-3细胞株购自北京协和细胞资源中心，四甲基偶氮唑蓝（MTT）购自美国AMRESCO公司，依维莫司购自上海前尘生物科技有限公司，小鼠抗β-actin单克隆抗体、兔抗p-4E-BP1多克隆抗体、兔抗p-P70-S6K多克隆抗体、山羊抗兔二抗均购自SantaCruz公司，流式细胞仪（Epics-XLⅡ）为美国BeckmanCoulter公司产品。

1.2方法

1.2.1细胞培养人前列腺癌PC-3细胞株培养于河北医科大学第四医院动物实验中心。取对数期生长期细胞进行实验。

1.2.2细胞增殖抑制实验（MTT法）设空白对照组（无细胞仅有培养液）、溶剂对照组（DSMO和培养液）、阴性对照组（细胞和培养液）及试验组；据如下公式计算肿瘤细胞抑制率：肿瘤细胞抑制率＝对照组A490值－用药组A490值／对照组A490值×100％；实验方法详见百度文库《MTT细胞增殖实验》。

1.2.3流式细胞仪（FCM）测定细胞周期设实验组（依维莫司溶液、培养液和细胞）、阴性对照组（加入等体积培养液和细胞），另设空白对照孔（只加培养液）。实验方法详见道客巴巴《流式细胞仪检测细胞周期》。

1.2.4Westernblot免疫印迹测定p-4E-BP1和p-P70S6K蛋白表达情况实验方法详见《丁香通-蛋白免疫印迹（Westernblot）》。

1.3统计分析

本研究统计分析由SPSS13.0软件完成，数据用mean±s表示，两组均数比较采用TTest，多组均数比较采用One-WayANOVA分析。P＜0.05视为具有统计学意义。

2结果

2.1依维莫司对人前列腺癌PC-3细胞增殖的影响

MTT结果表明，与对照组相比，依维莫司可抑制人前列腺癌PC-3细胞的增殖，且随着药物干预时间的延长，抑制率逐步增大（P<0.01）。（Fig.1）

3讨论

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammaltargetofrapamycin，mTOR）是一种新的Akt重要底物，首先由HEITMAN在1991年发现，处于PI3K/Akt/mTOR信号通路的下游，分子量为289kDa，属Ser/Thr蛋白激酶的一种，是磷脂酰肌醇激酶（PI3Ks）家族成员之一。

PI3K/Akt/mTOR信号通路将细胞外信号传递至细胞内，经激活/抑制相关重要蛋白的活性，在细胞的生存、分化、发育、增殖、迁移、凋亡、新陈代谢、血管生成及蛋白质合成等的调节中有着重要的生物学作用。mTOR作为Akt最重要的底物之一，当PI3K/Akt信号通路中的Akt被活化后，活化的Akt则顺序激活其下游的底物mTOR。而P70-S6K和4E-BP1则是mTOR的关键底物，它们可被mTOR磷酸化。核糖体蛋白P70-S6K的磷酸化，不仅增强了一些与编码核糖体蛋白和翻译调节蛋白相关的mRNA的翻译功能，而且使细胞周期素（cyclin）、细胞周期依赖性蛋白激酶4（CDK4）等细胞周期主要蛋白的表达增加，细胞周期则向G1期发展的速度增加，细胞周期循环加快，促进细胞的增殖和分化，从而促使前列腺癌的发生和发展[2]。4E-BP1则与真核细胞翻译启始因子4E（eIF-4E）形成复合物来抑制相关蛋白的表达。当4E-BP1被mTOR磷酸化后，致使4E-BPI从eIF-4E释放出来，削弱了4E-BPI对蛋白表达的抑制作用，却增加了如细胞周期蛋白D1、Rb蛋白、缺氧诱导因子-la、VEGF等促进细胞生长蛋白的表达，使细胞周期从G1期向S期进展，使细胞存活[3]。本实验中，依维莫司之所以能够抑制前列腺癌PC-3细胞的增值，将其阻滞在细胞周期的G0/G1期，就是因为mTOR被依维莫司所抑制，继而使其不能磷酸化P70-S6K和4E-BP1。而细胞周期的调节主要包括G1/S和G2/M两个检测点（Checkpoint），当机内外各组因素造成细胞基因组DNA完整性受到损害时，细胞不能越过G1/S或G2/M检测点，继续向下一期进展，此时细胞可通过自身修复机制修复受损基因组，通过检测点继续发育，如果无法修复损坏的基因组则启动凋亡系统来清除受损细胞。本实验中，依维莫司在将细胞周期阻止于G0/G1期的同时，也增加了细胞的凋亡数，可能与此有关。FuY等［4］在胃癌的研究中亦发现，通过Akt和mTOR，PI3K可将有丝分裂信号间接呈递给P70-S6K，上调了细胞周期蛋白的表达，使细胞周期向G1期进展，加速细胞周期，相反则抑制细胞周期进展。

相对于正常前列腺上皮细胞和良性前列腺增生上皮细胞，在前列腺癌细胞中发现p-Akt、mTOR、4EBP1和S6K1明显升高［5］，为此，我们使用依维莫司作用前列腺癌细胞株PC-3后，用Westernblot检测了不同时间点，p-4E-BP1和p-P70S6K蛋白的表达情况，结果显示，随药物干预时间的延长，p-4E-BP1和p-70-S6K的表达逐渐被抑制（P<0.01）。

因此，我们可以得出，依维莫司是通过阻断PI3K/Akt/mTOR信号传导通路中mTOR蛋白及其下游关键蛋白的磷酸化来抑制PC-3细胞的增值，并使其阻滞于细胞周期中G0/G1期，且一般认为，其主要是通过作用于P70-S6K和4E-BP1这两个下游的关键蛋白。

参考文献：

[1]RowinskyEK.Targetingthemoleculartargetofrapamycin（mTOR）[J].Currentopinioninoncology，2004，16（6）：564-575.

[2]方乐堃，曾宇慧，杨惠玲.PI3K/Akt/mTOR信号传导通路与泌尿系统肿瘤[J].国际内科学杂志，2007，34（9）：509-513.

[3]GuertinDA，SabatiniDM.DefiningtheroleofmTORincancer[J].Cancercell，2007，12（1）：9-22.

[4]FuY，ZhangQ，KangC，etal.InhibitoryeffectsofadenovirusmediatedAkt1andPIK3R1shRNAonthegrowthofmalignanttumorcellsinvitroandinvivo[J].CancerBiolTher，2009，8（11）：1002-1009.

[5]KremerCL，KleinRR，MendelsonJ，etal.ExpressionofmTORsignalingpathwaymarkersinprostatecancerprogression[J].TheProstate，2006，66（11）：1203-1212.