氨基酸手性拆分研究进展吴法浩

氨基酸手性拆分研究进展吴法浩

吴法浩

南京红杉生物科技有限公司江苏南京210000

摘要：氨基酸广泛应用于医药、食品及化妆品等行业。大多数氨基酸含有手性中心，存在D型和L型对映异构体。这两种异构体的生理作用多数情况下是不同或完全相反的。人工合成的氨基酸大多为外消旋体，必须手性拆分。本文综合国内外最新研究成果，对氨基酸拆分技术做了较系统综述。

关键词：氨基酸；手性拆分；研究进展

引言

自20世纪20年代L一谷氨酸钠开始应用以来,人们对氨基酸的利用开发日新月异,特别是近10多年来,氨基酸产品倍受人们关注,其应用更加广泛。为了更好的借助氨基酸对映体了解生命过程中药物作用的化学基础与生物基础,氨基酸的手性拆分已经引起了国内外广大专家学者的广泛关注,成为了对映体拆分的研究热点。目前,针对外消旋体的拆分已开发了优先结晶法、形成非对映体立体异构体结晶法、酶促法、色谱法、毛细管电泳法、膜拆分法和萃取法等。膜拆分法由于具有易于放大、可连续操作和能耗低等特点,所以被认为是一种极具潜力的大规模拆分手性物质的方法。关于手性拆分的膜分离技术,按膜的形态可分为液膜拆分技术和固膜拆分技术,而手性液膜由于均存在稳定性差的缺点,所以其应用受到了很大限制。为了获得更稳定的手性拆分系统,人们把更多的注意力投向了固膜拆分技术。本文研究的正是一种吸附选择型手性拆分固膜,可以用于氨基酸对映体的拆分,同时实现高选择性和高处理量的手性拆分过程,在获得单一光学纯度手性分子的研究中具有重要科学价值和理论意义。

1氨基酸的手性拆分方法

1.1间接法

手性衍生化试剂法（Chiralderivatizetionreagents，CDR），又可被称为间接法。该方法主要是利用含有手性中心的衍生化试剂对需要拆分的手性化合物进行衍生化，使手性分析物转变成非对映异构体，从而可在非手性柱上实现分离。

常用的手性衍生化试剂包括：异氰酸酯和异硫氰酸酯类、以苯并噁唑和苯并呋喃为母体类、萘衍生物类、三氟甲基磺酸酯类等。

手性衍生化试剂分子中一般含有发色团（紫外、荧光），因此间接法通常灵敏度高。但是该方法也存一些缺陷：（1）会出现消旋化问题；（2）衍生化步骤较繁琐；（3）手性衍生化试剂要求高（纯度100%）。

1.2手性流动相添加剂法

手性氨基酸对映体与加人到流动相中的手性添加剂间形成非对映异构体复合物,再用非手性柱分离。这种方法只适用于HPCE、HPLc和TLc。因为在GC中,流动相气体为惰性载体,能与之反应的氨基酸或固定相极少;而在HPCE、HPLc和TLc中,流动相是系统的动态部分,并与氨基酸和固定相互相影响。在该方法中,对映体的分离取决于其与手性流动相所形成的非对映异构体络合物的稳定性。

很多外消旋混合物可以通过添加适当的手性流动相在手性柱上得到分离。手性试剂有。一渭一、和,环糊精等。该方法优点是可采用通用的色谱柱分离,手性试剂种类多,改变手性相可以得到不同的手性选择性;缺点是手性试剂价格昂贵,操作条件复杂,分离后需要去除手性试剂。

1.3手性固定相法

手性固定相法（Chiralstationaryphases，CSPs），主要是利用固定相表面的手性选择剂与被测手性化合物形成非对映配合物，由于配合物的能量和稳定不同从而达到分离。随着不同种类的新型手性固定相的开发，手性固定相法成为氨基酸乃至手性药物等研究领域的首选对映体拆分方法。该方法具有简便、快速、高效等优点。根据手性分离机理及手性选择剂的不同可以将手性固定相分为以下几大类：刷型手性固定相（Pirkle型固定相）、多糖衍生物类手性固定相、环糊精类手性固定相、大环抗生素类手性固定相、冠醚类手性固定相等。

1.4复杂样品中微量D-型氨基酸的分离分析

D-型氨基酸被认为是哺乳动物体内一类重要的生物活性分子及某些疾病的生物标记物。因此对生物样品尤其是哺乳动物体内样品中的D-型氨基酸进行定量检测具有十分重要的生理意义。然而动物体内D-型氨基酸的含量是十分微量的，在检测时往往会受到大量存在的L-型氨基酸的干扰。HPLC法不仅可以通过选择不同种类的手性固定相来提高氨基酸对映体的手性选择性，而且可以选择合适的衍生化试剂来改变D-型和L-型氨基酸的出峰顺序，从而减少L-型氨基酸的影响。此外，也可以采用荧光衍生化试剂并结合荧光检测方法大大提高微量D-氨基酸的检测灵敏度，从而实现复杂样品基质中微量D-氨基酸的定性定量分析。

2氨基酸手性拆分研究进展

2.1化学拆分法

化学拆分法是研究最早的用于拆分光学异构体的方法之一，其机制、工艺最为成熟，多年来一直被企业广泛采用并批量生产。氨基酸的化学拆分原理如下：将外消旋氨基酸与拆分剂作用生成两种非对映异构体的氨基酸衍生物(如氨基酯，酰胺或盐)，利用非对映体物理化学性质的差异（通常为溶解度差异）分离，最后除去拆分剂，分别获得D-氨基酸和L-氨基酸。化学拆分法中，拆分剂的选择是影响拆分收率及产品光学纯度的重要因素。目前常用于外消旋氨基酸的拆分剂有酒石酸、樟脑磺酸、扁桃酸及其衍生物等。

2.2高效液相色谱法

高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。高效液相色谱分离手性物质的特点是灵敏、快速、分辨率高、重复性好、处理量大等。HPLC广泛用于手性氨基酸的拆分。

2.3膜拆分法

膜拆分法即膜分离法，其机制类似于采用手性配体交换色谱法拆分外消旋氨基酸，主要依赖氨基酸对映异构体与溶液中的金属阳离子及载有手性选择体的固定相形成三元配合物的稳定性差异。通常L-氨基酸形成的配合物比D-氨基酸稳定，故可将待拆分的氨基酸外消旋体选择性地吸附于手性渗透膜上，然后脱吸附，通过浓度差驱动将被吸附的氨基酸扩散至溶液中。根据拆分膜的状态，可分为固体膜拆分和液膜拆分两种。

液膜拆分法是利用液膜对氨基酸的某一对映异构体有比其他对映体更强的亲和力，基于选择性提取的原理达到拆分外消旋体的目的。液膜可分为支撑液膜（supportedliquidmembrane，SLM）、厚体液膜（bulkliquidmembrane，BLM）和乳化液膜（emulsifiedliquidmembrane，ELM）。

2.4气相色谱法

气相色谱分析是一种高效能、选择性好、灵敏度高、操作简单、应用广泛的分析、分离方法。气相色谱法分析氨基酸成本低,并且便于与质谱联用,确定氨基酸的结构,从而有可能发现新的氨基酸或测定非蛋白质氨基酸,这是自动化氨基酸分析仪所不及的。1966年手性氨基酸衍生化后,成功地利用气相色谱法进行了拆分。此后,气相色谱与液相色谱在对映体拆分方面得到了综合发展。

结束语

随着社会的发展，人们对氨基酸的需求量将越来越大。就氨基酸的手性拆分而言，化学拆分法是经典有效的拆分手段，需要的设备不多且操作简便，发展至今仍为获得手性氨基酸的基本方法，广泛用于工业生产。膜分离是一种节能技术，从连续性和能量有效的观点出发，通过手性膜拆分是很有应用前景的拆分手段。酶法具有拆分效率高、立体选择性高、反应条件温和、专一性强、操作简单和有利于环保等优点，使它在工业生产中具有很好的应用前景。色谱拆分法目前国内只是用于实验室的小量拆分，国外的模拟流动床色谱技术的成功应用，使运用色谱拆分法实现大量制备手性物质成为可能。提取拆分技术适用性强、便于连续拆分有望成为外消旋体拆分分离操作的先进技术。总之，能耗低、效率高、简便环保的拆分法是未来氨基酸拆分技术的主要发展重点。

参考文献

[1]吴慧慧.新型手性整体柱的制备及其在氨基酸手性拆分中的应用研究[D].暨南大学,2016.

[2]于平.生物转化和手性拆分技术制备D-氨基酸研究进展[J].生物学通报,2005(09):6-8.