玉米全粉中黄曲霉毒素B1标准物质的研制

玉米全粉中黄曲霉毒素 B1标准物质的研制

柳春洋

河南省豫南检测中心有限公司 河南省信阳市

摘要：目的：研制玉米全粉中黄曲霉毒素B1成分分析的标准物质。方法采用高效液相色谱法对玉米全粉中黄曲霉毒素B1候选物进行均匀性检验、稳定性考察,选取8家具有较高检测水平的实验室开展多家实验室联合定值。结果均匀性检验的方差分析结果显示F统计值＜F临界值。稳定性监测结果分析显示,候选物中黄曲霉毒素B1未观测到不稳定性。该标准物质具有良好的均匀性,可在常温(＜25℃)下保存,在低于60℃的条件下运输。玉米全粉中黄曲霉毒素B1标准物质定值结果为(27±3)μg/kg,k=2(95%置信区间)。结论本研究的标准物质均匀性、稳定性良好,定值结果准确。

关键词：玉米全粉；黄曲霉毒素B1；标准物质

引言

黄曲霉毒素是寄生曲霉、模式曲酶以及黄曲霉在一定温度条件下形成的真菌毒素，其对人体有较强的致癌性、致病性，同时也是严重的真菌毒素，B1、B2、G1、G2是污染粮食的重要黄曲霉毒素成分。根据我国有关规定，玉米、玉米面和玉米制品中，AFB1含量最高为20ug/kg。当前，对于黄曲霉毒素的检测方法包括薄层色谱法、酶联免疫法、胶体金试纸条法、液相色谱法、液质联用法等，但这些方法都各有优缺点。本研究玉米全粉中黄曲霉毒素B1成分的标准物质。

1资料与方法

1.1仪器与试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司);AutoEVA-60全自动浓缩氮吹仪[睿科仪器(厦门)有限公司];固相萃取仪(上海安谱实验科技股份有限公司);GT10-1高速台式离心机(北京时代北利离心机有限公司);HY-2调速多用振荡器(常州国华电器有限公司)。甲醇、乙腈(色谱纯,德国Merk公司);氯化钠(分析纯,中国医药集团有限公司);超纯水(香港Waston公司);AflaTest免疫亲和柱(3mL,美国VICAN公司);0.2mPTFE膜针头过滤器(美国PALL公司);有证标准物质GBW(E)100302甲醇中黄曲霉毒素B1[标准值为(1.96±0.06)μg/mL]、玉米全粉空白(国家粮食和物资储备局科学研究院)。

1.2实验方法

本研究采用的色谱柱为C18柱。流动相为45:55，甲醇水溶液流速设置为每分钟0.2mL，进样量为2uL，柱温设置为30℃，激发波长和发射波长分别为360nm和440nm。DON购自上海源叶生物科技有限公司，ZEA和AFB1购自Sigma公司；DON定量检测试剂盒购自江苏省苏微微生物研究有限公司，AFB1和ZEA定量检测试剂盒购自德国RBiopHarm公司；仔猪肠上皮细胞（IPEC-J2）由河南农业大学动物营养与饲料生物技术实验室保存。细胞培养基：10％胎牛血清、1％青链霉素混合液和89％高糖培养液充分混合均匀，4℃保存备用。取对数生长期细胞，常规消化计数后接种至96孔板，100μL/孔，每孔细胞数为1×104个，然后将细胞培养板置CO2培养箱培养24h，吸弃掉原培养液，加入PBS缓冲液清洗一遍，分别加入不同浓度的用细胞培养基稀释的霉菌毒素，对照组加入与试验组相同体积的培养基，每个处理组6个重复。24h后每孔加入10μL的MTT（终浓度为0.5mg/mL），37℃、5％CO2培养箱中共同孵化4h后，小心吸走培养液，加入150μL的DMSO，在低速振荡器上振荡10min使得甲瓒充分溶解，在酶标仪下测其490nm和630nm处的吸光度值（OD值），根据OD值计算细胞活率公式为：细胞活力/％=（试验组OD490nm值-试验组OD630nm值）/（对照组OD490nm值-对照组OD630nm值）×100。

1.3统计学方法

采用SPSS25.0对研究对象采集的数据进行分析处理，计量数据采用( ±s)表示；计数资料采用%表示，使用χ²对数据进行校检；P>0.05为差异无统计学意义。

2结果与分析

2.1均匀性检验分析

样品的均匀性检验采用单因素方差统计分析进行评定,样品检测时每次称样量为5.0g,样品间自由度为14,样品内自由度为30,在显著性水平n=0.05时,计算F值,将计算结果与查表得到的F临界值比较;若计算值小于F临界值,则表明在n=0.05的显著水平下,样品中黄曲霉毒素B1是均匀的,反之则不均匀。通过查表可知,临界值F0.05(14,30)=2.04,F统计值=1.31＜2.04。表明在0.05的显著性水平时,样品中黄曲霉毒素B1的含量均匀,具体数据及分析结果见表1、表2。

2.2标准物质联合定值结果

标准物质特性值的定值方法有许多有效的途径,包括一个或多个实验室用一种或多种方法进行测量。依据JJF1006—1994《一级标准物质技术规范》,选取的8家实验室使用一种测定方法对该标准物质的含量进行合作定值。对全部数据及各组数的平均值用偏态系数和峰态系数法检验正态性;对每组数据用格拉布斯(Grubbs)准则和狄克逊准则进行组内、组间可疑值检验,一般保留可疑值,剔除异常值;用科克伦法检验进行各组数据之间等精度检验,通过计算该组数据为等精度,本标准物质的标准值各家数据平均值再次计算平均值得出的总平均值,结果见表3。

3讨论

根据国标中黄曲霉毒素测定，采用免疫亲和净化的方式，使用普通HPLC分离柱后，碘溶液衍生荧光检测玉米中黄曲霉毒素，其AFB1检出限为100ug/kg。而本研究采用高效液相色谱进行检测时，无需衍生，并且灵敏度可提高两倍，其余黄曲霉毒素灵敏度也显著提高。按照上述方法进行空白样品加标，如下图所示，为玉米样品的加标色谱图。由于黄曲霉毒素具有强毒性、高稳定性和高致癌性等特点，不仅会影响粮食及饲料产品的经济效益，同时也潜在威胁着人类和动物的健康，探索去除或降低黄曲霉毒素的方法具有重要意义。近年来，芽胞杆菌属菌株针对黄曲霉及黄曲霉毒素的研究主要集中在两个方面，一是菌株具有抑制黄曲霉及其孢子生长的能力，活性组分多是脂肽类物质等；二是菌株具有降解黄曲霉毒素的能力，活性组分通常是蛋白类酶等，受高温和蛋白酶Ｋ影响大。

结束语

总之，本次研制的玉米全粉中黄曲霉毒素B1标准物质均匀性、稳定性良好、定值结果准确,通过研究发现，本研究具有良好的线性，且相关系数为0.9997，剂量为UL，样品加标回收率达93.9%-104.4%，相比普通液相色谱法来说，无需经过衍生处理，能够节约检测的时间，减少有机溶剂的使用量，操作相对简单、灵敏度较高，可用于粮食中黄曲霉毒素的快速测定。

参考文献

[1]赵欣欣,王殿轩,肖惠惠,刘鑫宇,刘浩星,孙奂一,都立辉.米扁虫对玉米中黄曲霉毒素B_1含量影响的研究[J].粮油食品科技,2019,27(06):109-113.

[2]唐彧,张琼琼,郭永鹏,郑雅文,赵丽红.一株同时降解玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B_1的谷氨酸棒状杆菌及其降解特性研究[J].饲料工业,2019,40(20):34-39.

[3]王春艳,聂绪恒,袁毅,蒋雁,向西.玉米中黄曲霉毒素B_1测定的不确定度评定[J].食品研究与开发,2019,40(16):89-94.

[4]殷勇,戴松松,于慧春.基于高光谱特征选择的霉变玉米黄曲霉毒素B_1的检测方法[J].核农学报,2019,33(02):305-312.

[5]王光辉,殷勇.基于高光谱融合神经网络的玉米黄曲霉毒素B_1和赤霉烯酮含量预测[J].食品与机械,2018,34(11):64-69.