黑木耳液体菌种培养基配方及培养条件优化

黑木耳液体菌种培养基配方及培养条件优化

隋杰 ,王子全 ,丁国峰

河北省食用菌液体菌种技术创新中心  050000

摘要：黑木耳(Auriculariaauricula)作为担子菌门中重要的药食同源真菌，含有丰富的氨基酸、多糖、黑色素和维生素等成分，具有增强机体免疫功能、补血、补脑、抗衰老、抗凝血和抑制肿瘤生长等保健效果和药用功效，是维持人体健康的绝佳食材。近年来，随着“菌粮”等新名词的出现，黑木耳在人类健康重要性中的体现越为明显。

关键词：黑木耳；液体菌种培养基配方；培养条件；优化

引言

木耳属(Auricularia)真菌是我国常见的野生食用菌，常生长于林间阔叶树倒木及枯死木桩，由于其特殊的生物学特性，木耳属真菌能够分解多种材料中的纤维素、半纤维素、木质素等物质提供生长所需的营养。木耳在我国栽培历史悠久，从初期的椴木“砍花”栽培到如今的袋料菌棒培育已有1000多年历史，经过食用菌工作者的努力和研究，木耳人工栽培技术目前已经趋于成熟，多篇文献报道了菌种驯化、栽培种生产、替代基质筛选等方面的内容，为食用菌产业生产提供了较好的指导和借鉴。

1.菌丝培养

将退化的黑木耳菌种接种到相应的母种培养基中(以ADA培养基为对照，不同浓度的麦麸、木屑、稻杆ADA培养基为实验组)，每个培养基接种直径3mm的黑木耳菌块，接种后置于26℃恒温箱中避光培养9d，期间注意观察菌丝的生长情况。

2.液体培养条件的优化

（1）培养时间、温度、pH值、碳源、氮源、无机盐的筛选：无菌条件下分别将2种野生木耳菌种打孔为大小相同的“菌饼”（直径0.5cm），接种至不同pH值（pH值为5、6、7、8、9）、不同碳源（蔗糖、麦芽糖、果糖、淀粉、葡萄糖）、不同氮源（蛋白胨、牛肉膏、尿素、(NH4)2SO4、酵母膏）、不同无机盐（MgSO4、CaCl2、CuSO4、NaCl、KH2PO4）的基础培养基中，于25℃，160r/min条件下摇床培养10d；培养时间及温度实验将菌种接种至基础培养基中，分别于25℃，160r/min条件下培养不同天数（2、4、6、8、10d）、以及不同温度（20、25、30、35、40℃）条件下，160r/min摇床培养10天。每瓶发酵培养液接种6个菌饼（150ml/瓶），每个单因素设置3个重复，按时取出不同培养条件的发酵培养物，过滤、洗涤，85℃烘4h后称重，记录不同培养条件下2种木耳菌丝干质量。2)正交实验在6个单因素实验的基础上，采用了L4（23）正交表对碳源、氮源、无机盐、进行实验设计，以获得2种野生木耳最佳的液体发酵培养条件。菌丝体是真菌重要的营养组织，其生长状况影响着真菌后期的生长发育和子实体的分化，培养条件，基质营养成分往往对菌丝体的形态和代谢产物产生重要的影响，所以培养条件优化是菌种培育，发酵生产等多个领域中的重要环节。

3.液体发酵条件

采用Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ、最陡爬坡、Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ响应面以及验证试验对黑木耳新品种的液体发酵工艺进行了优化，得到了最优的发酵工艺条件：马铃薯２００．０ｇ／Ｌ、葡萄糖５０．２７ｇ／Ｌ、蛋白胨４．５ｇ／Ｌ、麦麸１５．０ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４４．９３ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ１．０ｇ／Ｌ、初始ｐＨ值５．１、接种量４％、温度２８．０℃、１６０ｒ／ｍｉｎ摇床发酵８ｄ，菌丝干质量可达到２１．５７ｇ／Ｌ，比优化前提高了２３．５３％。响应面相较于其他优化方法，可以反映碳氮源等因素间的交互作用。与“葡萄糖是影响黑木耳菌丝生物量的显著性因素”的结论相同，这是由于在发酵初期黑木耳菌株不能产生分解复杂有机物的酶系，而单糖更容易得到吸收利用；与结论“影响黑木耳菌株神农Ａ８干质量顺序为ＫＨ２ＰＯ４含量＞葡萄糖含量＞牛肉粉含量”不同，影响菌丝干质量的顺序是初始ｐＨ值＞ＫＨ２ＰＯ４含量＞葡萄糖含量，可能是由菌种的差异导致；从液体菌种的实际生产来看，较高的菌丝生物量是判断液体菌种质量的一个重要标准，森盛１号在最优发酵工艺条件下的菌丝干质量比神农Ａ８多９４％，可见新品种森盛１号具有更大优势。另外，响应面分析得到的二次回归模型可以较好地反映试验的真实结果。本研究得到的菌丝干质量验证值（２１．５７ｇ／Ｌ）与最大预测值（２１．２ｇ／Ｌ）较接近，相对误差仅为１．７５％（＜５％）。因此，优化得到的森盛１号黑木耳液体发酵工艺是有效可行的，可为森盛１号新品种及其他黑木耳菌株的液体菌种生产提供科学依据。

4.菌丝生物量培养

不同复壮培养基的菌丝生物量，经过不同的母种培养基复壮之后，退化菌种的生物量(P＜0.01)均有不同程度的提高，其中，在ADA培养基中添加麦麸10g·L－1时，生物量达到最高，而后随着添加量的增加，生物量呈现下降趋势;添加稻杆的培养基则在15g·L－1时，生物量(P＜0.01)达到最高，之后逐渐下降;添加木屑的培养基的生物量则一直呈现上升趋势，在20g·L－1时达到最高;在所有的培养基中添加麦麸10g·L－1时生物量最大，达到1.330g·100ml－1。Nopotatoes培养基的生物量(P＜0.05)与ADA相比并没有较大的提高，并且木屑Nopotatoes有较大的下降。这说明将ADA中的马铃薯替换成其他天然物质不能有效提高菌丝生物量，而在ADA培养基中添加适量的天然物质可以很好地提高菌丝生物量。

5.黄芪水对木耳菌种培养的影响

添加黄芪水提物可显著提高深层发酵香菇菌丝体中的活性成分，其胞外多糖、胞内多糖、总酚酸、总黄酮和总皂苷含量分别为常规发酵对照的1.16、1.09、1.66、1.25、2.20倍。本试验也有类似发现，添加5mg/ml黄芪水提物后，深层发酵黑木耳菌丝体中的活性成分含量显著增加，其胞外多糖、胞内多糖、总酚酸、总黄酮和总皂苷含量分别为对照的1.88、1.24、2.65、1.61、1.85倍。可见，黄芪水提物能够促进深层发酵食药用菌活性成分的合成与积累。此外，添加5.0mg/ml黄芪水提物后，深层发酵黑木耳菌丝体的DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率、还原力和亚铁离子螯合率分别为常规发酵对照菌丝体的2.27、1.38、1.58、1.97倍。该结果也与其他学者的报道类似，刺五加固体栽培基质对黑木耳子实体营养成分及其多糖化学组成、抗氧化性的影响，发现刺五加的添加明显提高了黑木耳的营养成分和多酚含量，并改变了黑木耳单糖组成比例，其对氧自由基和ABTS+自由基的清除能力也分别提高了3.2倍和2.7倍。值得一提的是，在其他食药用菌的培养基质中添加生物活性物质也取得相似的效果。添加何首乌深层发酵后，灵芝菌丝体中多糖、总三萜和黄酮含量分别是对照的2.0、1.5倍和3.2倍；灵芝菌丝体中还原力、超氧阴离子自由基清除率和羟基自由基清除率分别是对照的4.5倍、1.5倍和2.0倍。由此可见，培养基质中添加生物活性物质，改变了黑木耳等食用菌化学成分的合成代谢途径，从而促进了其生物量、活性物质含量和功能的提升。本试验结果表明，黄芪水提物的添加可促进深层发酵黑木耳菌丝体的生长，并可提升其活性物质含量和抗氧化活性。本研究可为黄芪的开发利用及新型食药用菌产品的研发提供参考。后续可在黄芪添加对黑木耳和其他食药用菌子实体的形成、生产性能、化学成分、生物活性的影响方面展开深入研究。

结束语

综上所述，经过不同的复壮培养基培养后，菌种表现出不同的生长状态。在添加稻杆和木屑的培养基中，母种菌丝的生长速度及酶活性比添加麦麸具有更好的复壮效果，可能是稻杆和木屑中含有更多的木耳生长所缺失的营养素，从而使其复壮效果更好。而添加物浓度过高时，菌丝生长速度会下降，这是因为提供的氮源过高抑制了菌丝生长。

参考文献

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