简介：摘要

简介：摘要目的利用规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)-CRISPR相关蛋白9(CRISPR associated protein 9，Cas9)技术对痘苗病毒(vaccinia virus, VACV)胸腺激酶(thymidine kinase，TK)区进行定向重组，建立高效的痘苗病毒靶基因插入重组技术。方法设计合成靶向TK区的引导RNA(guide RNA, gRNA)对应的2条互补寡核苷酸，磷酸化修饰后变性退火，克隆到去除核定位信号的PX458载体上，同时改造原有TK区重组质粒。将gRNA及Cas9共表达质粒转染293T细胞，介导VACV与TK区重组质粒进行同源重组，然后通过蓝白斑的出现率评估病毒重组率。结果本研究中设计并合成的gRNA序列介导的重组效率大于1%，高于经典的同源重组方法10倍以上。结论本研究利用CRISPR/Cas9技术建立了高效痘苗病毒TK区重组体系，为新发突发传染病的疫苗或多价研究以及肿瘤治疗等提供临床前研究技术支持。

简介：摘要： CRISPR-Cas9技术是一种高效、精准、可重复的基因编辑工具，已经在生物学工程领域得到广泛应用。本文综述了CRISPR-Cas9技术在基因敲除、修饰、添加和调控等方面的应用研究，以及相关的应用案例和未来发展趋势。在植物基因编辑方面，CRISPR-Cas9技术已经成功应用于水稻、小麦、番茄等重要农作物的基因改良；在动物基因编辑方面，CRISPR-Cas9技术已经实现了猪、牛、鼠等动物的基因敲除和修饰；在微生物基因编辑方面，CRISPR-Cas9技术已经被广泛应用于工业微生物的基因改良和代谢工程。未来，随着CRISPR-Cas9技术的不断发展和完善，它将在生物学工程领域发挥越来越重要的作用，为生物学研究和生物技术开发带来更多的机遇和挑战。

简介：基因治疗是为网膜的退化疾病的潜在地有效的治疗。定期聚类interspaced短palindromic重复(CRISPR)/CRISPR-associated蛋白质9(Cas9)系统在眼的研究作为一个新编辑染色体的工具被开发了。在研究的最近的进展证明CRISPR/Cas9在在视网膜炎pigmentosa(RP)和leber的vivo产生动物模型以及基因治疗被使用了先天的黑(LCA)。它被与象联系adeno的病毒(AAV)那样的另外的技术结合也为诊所作为一次潜在的尝试显示出并且导致pluripotent干细胞(iPSCs)。在这评论，我们加亮在指向网膜的退化使用CRISPR/Cas9的进一步的前景的主要的点。我们也在治疗网膜的退化疾病强调这种技术的潜在的应用程序。

简介：Precisebaseeditingishighlydesiredinplantfunctionalgenomicresearchandcropmolecularbreeding.Inthisstudy,weconstructedarice-codonoptimizedadeninebaseeditor(ABE)-nCas9toolthatinducedtargetedA·TtoG·Cpointmutationofakeysinglenucleotidepolymorphismsiteinanimportantagriculturalgene.Combinedwiththemodifiedsingle-guideRNAvariant,ourplantABEtoolcanefficientlyachieveadeninebaseeditinginthericegenome.

简介：设计习俗的核酸酶技术例如定期聚类短palindromic重复(CRISPR)联系了的interspaced(Cas)系统提供为昆虫编辑工具的吸引人的染色体功能的遗传。指向的基因mutagenesis由CRISPR/Cas9系统调停了在包括的几份昆虫订单被完成了双翅目，鳞翅目和翘目。然而，小成功都没在这些由于genomic信息和胚胎的microinjection技术的缺乏在农业害虫被报导昆虫种类。这里，我们报导CRISPR/Cas9系统在重要鳞翅类的害虫Spodopteralitura导致了有效基因mutagenesis。我们指向了S。litura腹A(Slabd--一)是重要胚胎的发展基因并且在决定昆虫的腹的片断的身份起一个重要作用的基因。指导Cas9送信人RNA和Slabd-A-specific单人赛领队RNA(sgRNA)的注射进S。成功地导致的litura胚胎典型abd--缺乏的显型，它在幼虫的阶段期间显示出异常分割和宫外的色素沉着。聚合酶链基于反应的分析表明Cas9/sgRNA建筑群有效地在S导致了指向的mutagenesis。litura。这些结果证明CRISPR/Cas9系统是为在象S那样的鳞翅类的害虫的染色体操作的一个强大的工具。litura。

简介：摘要目的探究敲减角质形成细胞KRT5基因对共培养黑素细胞黑素含量的影响，以解释屈侧网状色素沉着症（DDD）的色素增加性皮损形成的机制。方法通过成簇的规律间隔的短回文重复序列-相关蛋白9（CRISPR-Cas9）技术获得KRT5基因杂合突变的HaCaT细胞，将转染非靶向单向导RNA：Cas9蛋白复合物的HaCaT细胞设为对照组，分别与人原代黑素细胞HEMn体外共培养。免疫荧光观察共培养细胞中细胞角蛋白及黑素小体表达；差异胰酶消化获得不同共培养组中黑素细胞，检测细胞内黑素含量。免疫组化检测1例KRT5突变DDD患者皮损和正常对照皮肤中黑素细胞特异性前黑素小体蛋白17（Pmel17）的表达改变。结果Sanger测序显示，实验组HaCaT细胞KRT5基因第1外显子起始密码子发生杂合突变（c.1delA），对照组HaCaT细胞KRT5基因未发生突变。Western印迹显示，实验组HaCaT细胞KRT5蛋白表达水平（0.60 ± 0.05）显著低于对照组（1.00 ± 0.00，t = 32.38，P = 0.001）。HEMn细胞与实验组HaCaT细胞共培养体系中Pmel17标记的黑素小体较与对照组共培养体系增多，且细胞内黑素含量增加52.5%，差异具有统计学意义（t = -3.48，P = 0.025）。KRT5突变DDD患者皮损组织中Pmel17表达量较正常对照皮肤增加。结论本研究通过CRISPR-Cas9诱导KRT5基因突变的HaCaT细胞，与黑素细胞在体外建立共培养细胞模型，验证了其对共培养黑素细胞的影响，为进一步研究角质形成细胞与黑素细胞相互作用机制以及皮肤色素异常的发病机制提供了初级研究模型。

简介：摘要规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)和CRISPR相关蛋白9(CRISPR associated protein，Cas9)组成的CRISPR/Cas9系统是大多数细菌和古细菌的一种免疫系统。该系统在动物模型构建、基因治疗和基因表达调控等众多领域发挥着强大的作用。但该系统的脱靶效应等原因所导致的效率低下和安全性问题一直是人们研究的重点。本文主要对CRISPR/Cas9系统从sgRNA、Cas9蛋白、递送系统、DSB修复通路、脱靶检测手段以及碱基编辑技术六个方面提高其编辑效率的改进方法进行综述。

简介：摘要CRISPR/Cas9是近年来发展起来的一种非常高效的基因组定点编辑技术。然而，很多研究表明设计的单一向导RNA(SingleguideRNA,sgRNA)通常会与基因组DNA发生一定概率的序列错配，从而引起非预期的基因组编辑，即所谓的脱靶效应(Off-targeteffects)。脱靶效应是制约CRISPR/Cas9基因编辑技术得以迅速发展的重要掣肘，CRISPR/Cas9脱靶检测则成为降低脱靶率的重要前提，引起了很多科学工作者的关注。本文将重点介绍现行的几种脱靶检测方法，并对其原理进行分析与对比研究。

简介：摘要成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/ CRISPR相关蛋白9（CRISPR-associated protein 9，Cas9）是利用向导RNA（guide RNA，gRNA）引导Cas9蛋白对靶向基因进行修饰的一种基因组定点编辑技术。由于其具有操作简单、特异性高、成本低廉、效率高等特点，一经问世便迅速风靡科研界，成为科学研究的一大利器。随着CRISPR/Cas9技术的不断成熟，其在疾病治疗中的潜力也逐渐被挖掘。本文对CRISPR/Cas9系统的工作原理、在人类疾病治疗中的最新进展和应用前景进行综述，以期为相关基础研究及临床治疗提供新的思路。

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简介：摘要单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)是导致人类疱疹性疾病的主要病原体，具有广泛宿主细胞类型、庞大外源基因容量等特点，因此也是一种颇具吸引力的病毒载体。HSV基因组较为庞大，对于病毒基因组的操作技术便成为关键环节。对该病毒基因组的操作先后经历了同源重组(homologous recombination),细菌人工染色体技术(bacterial artificial chromosome, BAC)和CRISPR/Cas9 (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat/CRISPR-associated nuclease 9 )技术。同源重组具有重组效率低、产物不易纯化等缺点，而且将大型病毒基因组克隆到BAC上是一个耗时耗力的过程。近年来，CRISPR/Cas9技术因其操作简便、重复性好、成本低廉等优势而被越来越多的研究者应用于各种物种的基因工程研究工作中，对于病毒基因组的操作也随之更加精确高效。本文对CRISPR/Cas9技术在HSV基因功能、治疗HSV感染性疾病及HSV载体研究中的应用进行综述，以期对相关的研究工作提供一定参考。

简介：摘要目的利用CRISPR/Cas9 (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat/CRISPR-associated nuclease 9)技术构建携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因的单纯疱疹病毒2型(herpes simplex virus 2，HSV-2)。方法利用CRISPR/Cas9技术对外源基因EGFP插入HSV-2基因组的策略进行探索，设计如下4种插入策略：(1)经典的同源重组修复模式，即环状双侧同源臂供体介导的基因敲入；(2)线性化单侧同源臂供体介导的基因敲入；(3)同源性非依赖介导的基因敲入；(4)利用稳表达Cas9和sgRNA的细胞株，进行环状双侧同源臂供体介导的基因敲入。结果使用策略2、3和4均成功构建了携带EGFP的HSV-2，其中策略2的基因敲入效率最高，然后依次为策略3、策略4，策略1未观察到重组病毒的产生。蚀斑纯化后的重组病毒在7代内能稳定表达绿色荧光蛋白，并且和亲本株在Vero细胞上具有相似的生长特性。结论线性化单侧同源臂供体介导的基因敲入效率更高，敲除载体的稳转细胞株能够有效地提高同源重组修复机制介导的基因敲入效率。

简介：摘要CRISPR（Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,成簇的规间隔短回文重复序列）/Cas(CRISPR关联）系统属于原核生物的免疫防御系统，该系统可识别外源DNA并将其切断来抵抗病毒干扰。根据其原理，CRISPR/Cas技术借助sgRNA（singleguideRNA）来引导Cas9核酸酶结合到特定的核酸序列实现目的基因位点的切割。CRISPR/Cas9是继锌指核酸酶（ZFN）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）后的一种广泛应用于基因组定位点编辑的有效工具，具有操作简单、实验周期短、成本低廉的优势，不可否认，这种基因编辑技术存在脱靶风险。为验证CRISPR/Cas9基因编辑的有效性和精确性，本实验将CPT1A基因作为靶基因，通过PCR增殖、靶基因与PCAG-EGxxFP载体连接，来形成载有CPT1A基因的质粒并转化入293T细胞系。研究图片显示，CPT1A载体在荧光显微镜下呈荧光，证明CRISPR/Cas9技术可进行基因编辑；只有部分基因呈现荧光状态，从而推测引导RNA的选择、非同源末端连接（HDR）修复效率低以及同源重组修复（NHEJ）的随机性影响了基因编辑的效率，所以CRISPR/Cas9技术仍存在改善之处。

简介：据LongCZ2018年1月31日[SciAdv,2018,4（1）：eaap9004-eaap9004.]报道,美国和德国研究人员通过研究描述了一种新的CRISPR方法,这种新方法或许有望利用Duchenne型肌营养不良（DMD）患者机体的多能干细胞来产生健康的心肌,这种新方法还克服了此前研究人员对DMD细胞进行基因编辑时遇到的多种问题。

简介：EliminationoftheCRISPR/Cas9constructsineditedplantsisaprerequisiteforassessinggeneticstability,conductingphenotypiccharacterization,andapplyingforcommercializationoftheplants.However,removaloftheCRISPR/Cas9transgenesbygeneticsegregationandbybackcrossislaboriousandtimeconsuming.WepreviouslyreportedthedevelopmentofthetransgenekillerCRISPR(TKC)technologythatusesapairofsuicidegenestotriggerself-eliminationofthetransgeneswithoutcompromisinggeneeditingefficiency.TheTKCtechnologyenablesisolationoftransgene-freeCRISPR-editedplantswithinasinglegeneration,greatlyacceleratingcropimprovements.Here,wepresentedtwonewTKCvectorsthatshowgreatefficiencyinbotheditingthetargetgeneandinundergoingself-eliminationofthetransgenes.ThenewvectorsreplacedtheCaMV35SpromoterusedinourpreviousTKCvectorwithtworicepromoterstodriveoneofthesuicidegenes,providingadvantagesoverourpreviousTKCvectorundercertainconditions.Thevectorsreportedhereofferedmoreoptionsandflexibilitytoconductgeneeditingexperimentsinrice.

简介：摘要CRISPR/Cas9及其衍生的基因编辑技术碱基编辑器和先导编辑器可对目标基因组进行精准编辑，已广泛应用于肿瘤的治疗，在肿瘤免疫疗法、治疗人乳头瘤病毒感染、构建高效溶瘤病毒等方面取得了显著成果，为肿瘤治疗提供了新手段。

简介：摘要利用在原核生物中观察到的规律成簇的间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）与相关的Cas（CRISPR- associated proteins）蛋白构成CRISPR-Cas系统作为真核细胞中的基因编辑工具为近年研究热点。效应蛋白由多个Cas蛋白组成，包括两个大类五型系统。Cas蛋白结合特定的核酸序列，具有核酸酶的功能用于可编程基因组编辑和表观遗传调控，同时在疾病诊断方面也有很好的发展前景。其中Cas6是一种独立于金属的单转位酶，依附在crRNA裂解产物上，可识别并在crRNA转录前的重复序列中裂解单个磷酸二酯键。核糖核酸内切酶Cas9为RNA引导的DNA裂解酶，是目前应用最广泛的基因编辑工具，同时在感染性疾病检测、癌性病毒感染的消除或灭活、肿瘤免疫治疗、肿瘤基因组和表观基因组的调控等方面显示出巨大的应用前景。RNA引导的核酸内切酶Cas12a具有两种不同的核酸酶活性，且该双重催化活性已被用于多重基因编辑。Cas12a的显著特性使其应用于目标DNA与RNA快速检测，成为CRISPR-Cas基因组编辑工具包的补充。RNA引导的RNA靶向核酸内切酶Cas13a是RNA引导、RNA激活的RNA酶，已被开发为RNA检测、RNA成像和RNA调控的强大工具，同时利用Cas13a构建高灵敏度及特异度的检测方法也可为感染性疾病在诊断过程中提供重要的理论依据。由此展开对CRISPR-Cas系统相关的Cas蛋白的深入研究，同时对上述系统在不同疾病中的重要应用等进行阐述，有助于为各项研究提供新思路，新方法。

简介：摘要成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统是一种利用RNA指导核酸内切酶进行基因编辑的技术，具有操作简便、靶向精准、周期短、基因敲除效率高等特点，被广泛用于多个物种的基因编辑及疾病基因治疗中。目前，采用该技术已构建了多种眼科疾病动物模型，如角膜营养不良模型(UBIAD1、TGF-β R124C基因突变)、青光眼模型(MYOC Y435H、OPTN E50K和PMEL基因突变)、白内障模型(GJA8、KPNA4、c-Maf、AQP5和PIKFYVE基因突变)、Leber先天性黑矇动物模型(KCNJ13和LCA5基因突变)、视网膜母细胞瘤动物模型(RB1/RBL基因突变)和视网膜色素变性动物模型(HKDC1、C8ORF37、CERKL、PRCD、ASRGL1、LRAT和PDE6B基因突变)等。还有研究者采用该基因编辑技术进一步证实了MFRP、CPAMD8、Pax6和FREM基因在动物眼部发育过程中的作用。本文就CRISPR/Cas9基因编辑技术在构建眼科疾病动物模型中的应用进行综述。